WO2012074038A1 - 修飾１本鎖ポリヌクレオチド - Google Patents

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WO2012074038A1
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小泉　誠
泰秀 廣田
麻紀子 中山
未佳 池田
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第一三共株式会社
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    • C12N2320/51—Methods for regulating/modulating their activity modulating the chemical stability, e.g. nuclease-resistance

Definitions

  • the present invention relates to a single-stranded polynucleotide having an RNA interference action and / or a gene expression suppressing action, use of the polynucleotide, a gene expression suppressing method using the polynucleotide, a pharmaceutical containing the polynucleotide, and the like.
  • RNA interference was first reported in nematodes (see, for example, Non-Patent Document 1), and then also reported in plants (see, for example, Non-Patent Document 2).
  • a double-stranded RNA (small interfering RNA: siRNA) having a 2 nucleotide overhang at the 3 ′ end and consisting of 21 nucleotides each of sense and antisense strands may have an RNA interference action in cultured vertebrate cells.
  • siRNA small interfering RNA
  • RNase RNase
  • Examples of the double-stranded polynucleotide having a stable RNA interference action against RNase include a double-stranded polynucleotide having a nucleotide unit in which DNA and 2′-OMeRNA are alternately combined instead of RNA constituting siRNA. It has been reported (see Patent Document 1).
  • siRNAs having a 6-aminohexyl phosphate group at the 5 'end of the sense strand or antisense strand have target mRNA expression inhibitory activity (see, for example, Non-Patent Document 5).
  • siRNAs having the same 6-aminohexyl phosphate group at the 5 'end of the antisense strand are reported to have no target mRNA expression inhibitory activity (see, for example, Non-Patent Document 6).
  • siRNA having a 3-aminopropyl phosphate group at the 5 ′ end of the sense strand has a target mRNA expression suppressing activity
  • siRNA having a 3-aminopropyl phosphate group at the 5 ′ end of the antisense strand is targeted It has been reported that there is no activity of suppressing mRNA expression (see, for example, Non-Patent Document 7).
  • siRNA having the same 6-aminohexyl phosphate group or 3-aminopropyl phosphate group at the 5 ′ end of the antisense strand shows a decrease in target mRNA expression inhibitory activity compared to unmodified siRNA, but completely It has been reported that the activity is not lost (for example, see Non-Patent Document 8).
  • siRNA having fluorescein at the 5 'end of the sense strand or antisense strand also has a target mRNA expression inhibitory activity (see, for example, Non-Patent Document 9).
  • siRNA having a steroid or lipid structure at the 5 ′ end of the sense strand or siRNA having a steroid or lipid structure at the 5 ′ end of the sense strand or antisense strand has activity to suppress the expression of target mRNA (For example, see Non-Patent Document 8).
  • siRNA in which the 3 ′ end of the sense strand and the 5 ′ end of the antisense strand are joined by a loop consisting of about 4 nucleotide units is a single-stranded polynucleotide, called short hairpin RNA (shRNA). . It has been shown that the activity of a shRNA having a stem portion of 19 base pairs is lower than that of a 19 base pair siRNA having the same base sequence (see, for example, Non-Patent Document 9).
  • a shRNA consisting of a 19 base pair stem in which two nucleotides in the loop were replaced with a non-nucleotide linker such as a propyl phosphate unit was synthesized and its target mRNA expression inhibitory activity was measured, but compared with unmodified shRNA. Therefore, the improvement of activity is not recognized (for example, refer nonpatent literature 9).
  • siRNA an orthonitrobenzyl derivative is used as siRNA in which the 3 'end of the sense strand and the 5' end of the antisense strand are connected by a non-nucleotide linker (see, for example, Non-Patent Document 8).
  • the 19-base-pair siRNA bound with this orthonitrobenzyl derivative has a reduced target mRNA expression-suppressing activity compared to unmodified siRNA. Further, the cultured cells transfected with this siRNA were irradiated with UV for 10 minutes, and the target mRNA expression inhibitory activity was measured, but the target mRNA expression inhibitory activity was reduced as compared with unmodified siRNA.
  • RNA kinase hClp1 is responsible for 5'-phosphorylation of siRNA (see, for example, Non-Patent Document 13).
  • siRNA phosphorylated at the 5 ′ end and siRNA not phosphorylated at the 5 ′ end were introduced into cells and the RNAi activity was compared, there was no difference in the activity between the two.
  • Oxidized siRNA is considered to be easily phosphorylated in cells (see, for example, Non-Patent Document 9).
  • the antisense strand having a phosphate group at the 5 ′ end is cleaved by Dicer or endonuclease in the cell.
  • Dicer or endonuclease for example, refer nonpatent literature 9
  • the propyl phosphate units are resistant to nucleases, so that cleavage by Dicer or endonuclease in cells cannot be expected (for example, Non-patent document 9).
  • the 19-base-pair shRNA having an orthonitrobenzyl derivative in the loop can be expected to generate an antisense strand having a phosphate group at the 5 ′ end by UV irradiation.
  • UV irradiation it is difficult to apply UV irradiation to a living body (for example, see Non-Patent Document 8).
  • an antisense strand that is cleaved by Dicer or endonuclease in the cell to produce a 5′-terminal phosphate group has a non-nucleotide-only linker in the loop, and has a stem of 19 base pairs or less
  • a single-stranded polynucleotide consisting of is not known.
  • the present inventors have intensively studied to obtain a polynucleotide having an RNA interference action and / or a gene expression suppression action. As a result, a sense strand for a target gene having an RNA interference action and / or a gene expression suppression action.
  • One object of the present invention is to provide a polynucleotide having an RNA interference effect and / or a gene expression suppression effect.
  • One object of the present invention is to provide a polynucleotide having an RNA interference action and / or a gene expression suppression action that are stable to RNase.
  • Another object of the present invention is to provide a method for suppressing gene expression with the above polynucleotide.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical containing the above polynucleotide.
  • the present invention (1) A polynucleotide having a sense strand polynucleotide for a target gene and an antisense strand polynucleotide having a base sequence complementary to the sense strand polynucleotide, the 5 ′ end of the antisense strand polynucleotide and the polynucleotide A polynucleotide or a salt thereof linked to each of the 3 ′ ends of the sense strand polynucleotide by a linker having the structure represented by the following formula forming a phosphodiester structure
  • R 1 , R 2 and R 3 is a structure represented by the following formula: -L 1- (CH 2 ) m -L 2 -L 3- (CH 2 CH 2 O) n1- (CH 2 ) n2 -O ⁇
  • m represents an integer of 0 to 4
  • n1 represents an integer of 0 to 4
  • n2 represents 0 or an integer from 2 to 10
  • L 1 represents a single bond or —O—
  • L 2 represents a single bond or —CH (—NH—L 4 —R) —
  • L 3 represents a single bond, — (C ⁇ O) —NH—, or —NH— (C ⁇ O) — based on the bond with L 2 .
  • n2 is an integer of 2 to 10.
  • L 1 and L 2 are single bonds and m is 1, n1 and n2 are 0, L 3 —O ⁇ -CH (COOH) NH- (amino acid residue) j -Ser, -CH (COOH) NH- (amino acid residue) j -Thr, -CH (NH 2 ) CO- (amino acid residue) j -Ser, or -CH (NH 2 ) CO- (amino acid residue) j -Thr,
  • these hydroxyl groups of serine and threonine are bonded to the phosphate group at the 3 ′ end of the sense strand polynucleotide, and the amino group of serine and threonine may be substituted with an acyl group
  • j represents an integer of 0 to 2
  • L 4 represents a single bond, — (C ⁇ O) — (CH 2 ) k —NH—, or
  • a hydrocarbon oxycarbonyl group is shown.
  • the remaining two of R 1 , R 2 and R 3 are each independently Hydrogen atom, An alkyl group having 1 to 8 carbon atoms which may have a substituent, An alkoxy group having 1 to 8 carbon atoms which may have a substituent;
  • a halogen atom An alkylcarbonylamino group having an alkyl group having 1 to 9 carbon atoms, and an alkylcarbonyl group containing an optionally substituted alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, A group selected from the group consisting of: (2) The polynucleotide or salt thereof according to (1), wherein R 1 and R 3 are hydrogen atoms, (3) The polynucleotide according to (2), wherein L 1 and L 2 are a single bond, L 3 is — (C ⁇ O) —NH—, and the sum of m and n 2 is an integer of 3 or more.
  • a polynucleotide or a salt thereof (7) The poly described in (2), wherein L 1 and L 2 are a single bond, L 3 is — (C ⁇ O) —NH—, m is 0 or 2, and n 2 is 8. Nucleotides or salts thereof, (8) R 1 and R 3 are hydrogen atoms, L 1 and L 2 are single bonds, L 3 is — (C ⁇ O) —NH—, m is 2, and n 2 is 8.
  • L 5 represents a single bond or —O—
  • L 6 represents — (C ⁇ O) —NH— or —NH— (C ⁇ O) — based on the bond with (CH 2 ) p ;
  • the bonding position on the benzene ring of L 5 is para-position or meta-position
  • L 5 is —O—
  • p represents an integer of 1 to 4
  • the sum of p and q is an integer of 3 or more, L 5 is a single bond, L 6 is — (C ⁇ O) —NH—, and the bond position on the benzene ring of L 5 is The polynucleotide or salt thereof according to (9), (11)
  • the sum of p and q is an integer of 8 or more, L 5 is a single bond, L 6 is — (C ⁇ O) —NH—, and the bond position on the benzene ring of L 5 is The polynucleotide or salt thereof according to (9), (11)
  • the sense strand polynucleotide comprises a polynucleotide represented by the following formula (IV)
  • the antisense strand polynucleotide comprises a polynucleotide represented by the following formula (V), and the following (a) to (d):
  • the polynucleotide or salt thereof according to any one of (1) to (15) having the characteristics shown in 5 ′-( ⁇ - ⁇ ) 9 - ⁇ p - ⁇ t -3 ′ (IV) 5'- ⁇ s- ( ⁇ - ⁇ ) 9 - ⁇ u -3 '(V) (A) ⁇ and ⁇ are
  • the sense strand polynucleotide is composed of a polynucleotide represented by the following formula (VI)
  • the antisense strand polynucleotide is composed of a polynucleotide represented by the following formula (VII), and the following (a) to (d)
  • ⁇ - ( ⁇ - ⁇ ) 8 - ⁇ p consists of the same nucleotide sequence as the target gene;
  • D made of expressions in (VI) ( ⁇ - ⁇ ) 8 and the formula in (VII) ( ⁇ - ⁇ ) 8 is mutually complementary nucleotide sequences, (19) The polynucleotide or salt thereof according to (17) or (18), wherein ⁇ is DNA and ⁇ is 2′-OMeRNA, (20)
  • the ⁇ t and ⁇ u are the same or different and are either DNA having thymine base, adenine base or guanine base, or 2′-OMeRNA having uracil base, adenine base or guanine base,
  • the polynucleotide or salt thereof according to any one of (16) to (19), (21) The polynucleotide or salt thereof according to any one of (16) to (19), (21) The polynucleotide or salt thereof according to any one of (16) to (19), (21) The polynucle
  • Tr represents a hydroxyl-protecting group
  • p represents an integer of 0 to 4
  • q represents an integer of 4 to 10
  • L 5 represents a single bond or —O—
  • L 6 represents — (C ⁇ O) —NH— or —NH— (C ⁇ O) — based on the bond with (CH 2 ) p
  • the bond position on the benzene ring of L 5 is para-position. Or it is a meta position.
  • Tr is a 4-methoxytrityl group, 4,4′-dimethoxytrityl group, pixyl group, trityl group, levulinyl group, or bis (trimethylsilyloxy) (cyclohexyloxy) silyl group, A polynucleotide or a salt thereof, (34) Tr is a 4-methoxytrityl group or a 4,4′-dimethoxytrityl group, the sum of p and q is an integer of 3 or more, L 5 is a single bond, and L 6 is — (C ⁇ O) —NH—, and the binding position on the benzene ring of L 5 is the para position, or the polynucleotide or a salt thereof according to (32), (35) Tr is a 4-methoxytrityl group or a 4,4′-dimethoxytrityl group, the sum of p and q is an integer of 8 or more, L 5
  • W 2 ′ represents a sense strand polynucleotide excluding 5′-end and 3′-end hydroxyl groups, and W 1 ′ -Y ′ represents a 5′-end and 3′-end hydroxyl group
  • X is an antisense strand polynucleotide, wherein X is a compound of formula (XII)
  • L 5 represents a single bond or —O—
  • L 6 represents (CH 2 ) p — (C ⁇ O) —NH— or —NH— (C ⁇ O) — is shown with the bond as a base point, and the bond position on the benzene ring of L 5 is the para or meta position, and L 5 is — When it is O-, p represents an integer of 1 to 4.
  • R 4 represents a 2-cyanoethyl group, a methyl group, a methanesulfonylethyl group, a 2,2,2-trichloroethyl group, or a 4-chlorophenylmethyl group
  • R 5 represents a morpholino group, a diisopropylamino group, , Diethylamino group or dimethylamino group.
  • Tr and Tr 1 may be the same or different and each may be a 4-methoxytrityl group, a 4,4′-dimethoxytrityl group, a pixyl group, a trityl group, a levulinyl group, or a bis (trimethylsilyloxy) (cyclohexyloxy) silyl group.
  • Tr and Tr 1 are the same or different and are 4-methoxytrityl group or 4,4′-dimethoxytrityl group, the sum of p and q is an integer of 3 or more, and L 5 is a single bond L 6 is — (C ⁇ O) —NH—, and the bonding position on the benzene ring of L 5 is the para position, (44) Tr and Tr 1 are the same or different and are a 4-methoxytrityl group or a 4,4′-dimethoxytrityl group, the sum of p and q is an integer of 8 or more, and L 5 is a single bond L 6 is — (C ⁇ O) —NH—, and the bonding position on the benzene ring of L 5 is the para position, (45) Tr and Tr 1 are the same or different and are a 4-methoxytrityl group or a 4,4′-dimethoxytrityl group, p is 0 or 2,
  • Tr and Tr 1 are the same or different and are a 4-methoxytrityl group or a 4,4′-dimethoxytrityl group, p is 0 or 2, q is 8, L 5 is a single bond
  • Tr and Tr 1 are the same or different and are a 4-methoxytrityl group or a 4,4′-dimethoxytrityl group, p is 2, q is 8, L 5 is a single bond
  • Tr and Tr 1 are the same or different and are a 4-methoxytrityl group or a 4,4′-dimethoxytrityl group, p is 2, q is 8, L 5 is a single bond
  • Tr and Tr 1 are 4,4′-dimethoxytrityl groups, p is 2, q is 8, L 5 is a single bond, and L 6 is — (C ⁇ O) —
  • R 4 is a 2-cyanoethyl group, a methyl group, a methanesulfonylethyl group, a 2,2,2-trichloroethyl group, or a 4-chlorophenylmethyl group
  • R 5 is a morpholino group, a diisopropylamino group, a diethylamino group
  • the front of X indicates a sense strand polynucleotide for the target gene
  • the rear of X indicates a polynucleotide having an antisense strand polynucleotide having a base sequence complementary to the sense strand polynucleotide
  • X is a formula (XVII).
  • terminal methylene group is bonded to the 3 ′ end of the sense strand polynucleotide to form a phosphodiester bond
  • oxygen atom bonded to the phenyl group is the antisense strand poly. It binds to the 5 'end of the nucleotide to form a phosphodiester bond.
  • a medicament comprising the polynucleotide or salt thereof according to (54) as an active ingredient
  • the medicament according to (55) for treating a disease resulting from expression of the Hsp47 gene (57) The medicament according to (56), wherein the disease derived from expression of the Hsp47 gene is fibrosis,
  • a method for suppressing the expression of the Hsp47 gene comprising administering the polynucleotide or a salt thereof according to (54) to a mammal,
  • a polynucleotide having an RNA interference effect and / or a gene expression suppression effect is provided.
  • the present invention also provides a polynucleotide having a stable RNA interference action and / or gene expression suppression action for at least one selected from RNase, phosphatase, and exonuclease.
  • the present invention also provides a polynucleotide having a stable RNA interference action and / or gene expression suppression action against RNase, phosphatase, and exonuclease.
  • a step of producing a sense strand polynucleotide and an antisense strand polynucleotide there is no need for a step of producing a sense strand polynucleotide and an antisense strand polynucleotide, and a complicated operation for accurately mixing both strands to form a double strand is required.
  • a polynucleotide which is unnecessary and has an RNA interference effect and / or a gene expression suppression effect. Functional analysis of various genes can be performed using the polynucleotide, and a pharmaceutical product containing the polynucleotide is provided.
  • the present invention also provides a synthetic intermediate useful for obtaining the polynucleotide.
  • the present invention also provides a method for producing the polynucleotide.
  • summary of A-1 process The figure which shows the outline
  • black circles ( ⁇ ) indicate DNA and white circles ( ⁇ ) indicate 2'-O-methyl RNA.
  • the black circle-white circle line indicates a phosphodiester bond between nucleosides.
  • p represents —P ( ⁇ O) (OH) —, and when p is bonded, the hydrogen atom of the hydroxyl group at the end of the polynucleotide is removed.
  • n represents the number of carbon atoms. The same applies to FIGS. 7 and 11. The base sequence of each polynucleotide is also shown. The figure which shows the polynucleotide with respect to a human beta-catenin gene.
  • the figure which shows the gene suppression activity of the polynucleotide by real-time PCR analysis The figure which shows the gene suppression activity of the polynucleotide by real-time PCR analysis.
  • the figure which shows the polynucleotide with respect to a human beta-catenin gene The figure which shows the gene suppression activity of the polynucleotide by real-time PCR analysis.
  • the figure which shows the polynucleotide with respect to a human beta-catenin gene The symbols, white squares ( ⁇ ) indicate RNA, black circles ( ⁇ ) indicate DNA, and white circles ( ⁇ ) indicate 2'-O-methyl RNA.
  • a line connecting each nucleoside indicates a phosphodiester bond.
  • p represents —P ( ⁇ O) (OH) —, and when p is bonded, the hydrogen atom of the hydroxyl group at the end of the polynucleotide is removed.
  • n represents the number of carbon atoms. The same applies to FIG. 15, FIG. 16, and FIG. The base sequence of each polynucleotide is also shown. The figure which shows the gene suppression activity of the polynucleotide by real-time PCR analysis.
  • mouth PKR gene The figure which shows the polynucleotide with respect to a rat and a human Hsp47 gene.
  • s represents a phosphorothioate bond.
  • concentration of the polynucleotide As the concentration of the polynucleotide, a white bar indicates a case of 0.1 nM, and a black bar indicates a case of 1 nM.
  • FIGS. 18 and 20 The figure which shows the gene suppression activity of the polynucleotide by real-time PCR analysis.
  • the “target gene” is not particularly limited as long as it is RNA in a cell, tissue, or solid into which the gene is introduced (hereinafter sometimes referred to as “subject”).
  • it may be non-coding RNA that is not translated into protein, even mRNA that is translated into protein.
  • Non-coding RNA includes functional RNA such as untranslated region of mRNA, tRNA, rRNA, mRNA-type ncRNA (mRNA-likenon-coding RNA), long ncRNA (long non-coding RNA), snRNA (small nucleic RNA) ), SnoRNA (small nuclear RNA), miRNA (microRNA) and the like.
  • it may be endogenous to the recipient to be introduced or exogenous introduced by a technique such as gene introduction. Further, it may be a gene present on the chromosome or an extrachromosomal one. Examples of exogenous genes include, but are not limited to, those derived from viruses, bacteria, fungi, or protozoa that can infect the recipient. The function of the gene may be known or unknown.
  • target genes can include genes that are specifically up-regulated and / or specifically mutated in patients with a particular disease.
  • diseases include central diseases ( For example, Alzheimer's disease, dementia, eating disorders, etc., inflammatory diseases (eg, allergies, rheumatism, osteoarthritis, lupus erythematosus, etc.), cardiovascular diseases (eg, hypertension, cardiac hypertrophy, angina, arteriosclerosis) , Hypercholesterolemia, etc.), cancer (eg, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, stomach cancer, pancreatic cancer, liver cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, colon cancer, rectal cancer, etc.
  • central diseases For example, Alzheimer's disease, dementia, eating disorders, etc., inflammatory diseases (eg, allergies, rheumatism, osteoarthritis, lupus erythematosus, etc.), cardiovascular diseases (eg, hypertension, cardiac hypertrophy, angina, arteriosclerosis) , Hypercholesterolemia
  • Respiratory diseases eg, pneumonia, bronchitis, asthma, chronic obstructive pulmonary disease
  • diabetes diabetic retinopathy, diabetic nephropathy, anemia (eg, anemia associated with chronic disease, iron refractory iron deficiency) Anemia)
  • Age-related macular degeneration immune system disease (eg, Crohn's disease, atopic dermatitis, autoimmune disease, immune deficiency, leukemia, etc.), liver / gallbladder disease (eg, non-alcoholic steatohepatitis, cirrhosis, hepatitis, liver Insufficiency, cholestasis, stones, etc.), gastrointestinal diseases (eg, ulcers, enteritis, malabsorption), infections, obesity, fibrosis (pulmonary fibrosis, liver fibrosis, renal fibrosis, myelofibrosis, etc.)
  • causative genes of these diseases include, for example, kinesin spindle protein (K
  • PLK p lo-like Kinase
  • ApoB-100 ApoB-100
  • Ribonucleotide reduced M2 subunit RRM2
  • clusterin Ribonucleotide reduced M2 subunit
  • Hsp27 heat shock protein 27
  • survivin-4 survivin-4
  • survivin-4 survivin-4
  • survivin elite-4.
  • IL-4R-alpha interleukin 4 receptor
  • Factor XI Factor VII
  • N-ras H-ras
  • K-ras K-ras
  • bcl-2 bcl-xL
  • Her-1 Her- 2, Her-3, H er-4, MDR-1
  • human ⁇ -catenin gene DDX3 (DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 3, X-linked
  • MCL1 Myloid Cell Leukemia Sequence 1
  • PKR2 PCL2
  • PKR2 Examples include, but are not limited to, Hsp47 (Serpinh1), Hepcidin, activated protein C (APC), survivin, signal transducer and activator of transcription (STAT3).
  • “natural nucleoside” means 2′-deoxyadenosine, 2′-deoxyguanosine, 2′-deoxycytidine, 2′-deoxy-5-methylcytidine, thymidine and other 2′-deoxynucleosides. Ribonucleosides such as adenosine, guanosine, cytidine, 5-methylcytidine, uridine and the like. “Oligonucleotide” refers to an oligonucleotide composed of a compound in which the sugar moiety of a nucleoside forms an ester with phosphoric acid. In the present specification, oligonucleotide and polynucleotide are used in the same meaning.
  • 2'-deoxy adenosine herein A t, 2'-deoxyguanosine and G t, 2'-deoxycytidine and C t, 2'-deoxy-5-methylcytidine 5meC t, thymidine T t, 2'-deoxyuridine may be represented as U t , adenosine as A rt , guanosine as G rt , cytidine as C rt , 5-methylcytidine as 5 meC rt , and uridine as U rt .
  • 2′-deoxyadenosine nucleotide is represented by A p , 2′-deoxyguanosine nucleotide by G p , 2′-deoxycytidine nucleotide by C p , and 2′-deoxy-5-methylcytidine nucleotide by 5 meC p , thymidine nucleotides T p , 2′-deoxyuridine nucleotides U p , adenosine nucleotides A rp , guanosine nucleotides G rp , cytidine nucleotides C rp , 5-methylcytidine nucleotides 5 meC rp , uracil nucleotides U It may be expressed as rp .
  • sugar-modified nucleoside refers to a nucleoside in which the sugar moiety of the nucleoside is modified.
  • examples of 2′-O-methyl modification include 2′-O-methyl nucleoside and 2′-O-methyl nucleotide, and those corresponding to A rt are assumed to correspond to A m1t and G rt.
  • G m1t, C m1t as corresponding to C rt, 5meC m1t as corresponding to 5meC rt, U m1t as corresponding to U rt, a m1p as corresponding to a rp, as corresponding to the G rp G m1p, C m1p as corresponding to C rp, 5meC m1p as corresponding to 5meC rp, U m1p as corresponding to U rp, a m1s as corresponding to a rs, as corresponding to the G rs G m1s, C m1s as corresponding to C rs, 5meC as corresponding to 5meC s 1s, may represent a
  • 4'-C-is ethylene nucleotide unit and the "ENA unit” refers to those having ENA at each nucleoside, each nucleotide of the, A 2t as corresponding to A t, A a e2p as corresponding to p, with respect to the a s a e2s, G 2t as corresponding to G t, G e2p as corresponding to G p, G E2S for G s, the 5meC t Corresponding to C 2t , 5 meC p corresponding to C e2p , 5 meC s for C e2s , T t corresponding to T t , T p corresponding to T p , for T e2p , T s
  • nucleosides and nucleotides having an ENA unit such as T e2s are also represented.
  • the 2′-O, 4′-C-methylene nucleotide unit and the “2 ′, 4′-BNA / LNA unit” mean the above nucleosides and the 2 ′, 4′-BNA / LNA in each nucleotide.
  • the polynucleotide in the present specification or a salt thereof is derived from a double-stranded polynucleotide having a sense strand polynucleotide for a target gene and an antisense strand polynucleotide having a base sequence complementary to the sense strand polynucleotide,
  • the antisense strand has a single-stranded structure in which the 5 ′ end of the antisense strand and the 3 ′ end of the sense strand are joined by a linker having a structure represented by the following structural formula, each forming a phosphodiester structure. It is.
  • polynucleotide-3′-P ( ⁇ O) (OH)-[linker] -P ( ⁇ O) (OH) -5′-polynucleotide is formed.
  • polynucleotide-3 ′ represents a structure having no hydrogen atom on the hydroxyl group at the 3 ′ end of the polynucleotide
  • “5′-polynucleotide” represents a hydroxyl group at the 5 ′ end of the polynucleotide.
  • a structure having no hydrogen atom is shown.
  • This linker contains a phenyl group, and represents the oxygen atom portion bonded to the phenyl group, the oxygen atom specified in the structural formula of the following chemical formula 18, but bonded to the 5 ′ end of the antisense strand. And is linked by forming a phosphodiester bond at the 5 ′ end.
  • This phenyl group further has R 1 , R 2 and R 3 , one of which serves as a binding site with the 3 ′ end of the sense strand to form a phosphodiester bond for binding.
  • R 1 , R 2 and R 3 to the phenyl group is via an oxygen atom, these oxygen atoms do not serve as the binding site to the 5 ′ end of the antisense strand.
  • the structure of this linker is as follows.
  • R 1 , R 2 and R 3 is a structure represented by the following formula: -L 1- (CH 2 ) m -L 2 -L 3- (CH 2 CH 2 O) n1- (CH 2 ) n2 -O ⁇
  • m represents an integer of 0 to 4
  • n1 represents an integer of 0 to 4
  • n2 represents 0 or an integer from 2 to 10
  • L 1 represents a single bond or —O—
  • L 2 represents a single bond or —CH (—NH—L 4 —R) —
  • L 3 represents a single bond, — (C ⁇ O) —NH—, or —NH— (C ⁇ O) —
  • n2 is an integer of 2 to 10.
  • L 1 and L 2 are single bonds and m is 1, n1 and n2 are 0, L 3 —O ⁇ -CH (COOH) NH- (amino acid residue) j -Ser, -CH (COOH) NH- (amino acid residue) j -Thr, -CH (NH 2 ) CO- (amino acid residue) j -Ser, or -CH (NH 2 ) CO- (amino acid residue) j -Thr,
  • the serine or threonine hydroxyl group is bonded to the phosphate group at the 3 ′ end of the sense strand polynucleotide to form a phosphodiester structure
  • j represents an integer of 0 to 2
  • L 4 represents a single bond, — (C ⁇ O) — (CH 2 ) k —NH—, or — (C ⁇ O) — (CH 2 ) k —
  • k represents an integer of 1 to 6
  • R is a
  • R 1 , R 2 and R 3 are each independently Hydrogen atom, An alkyl group having 1 to 8 carbon atoms which may have a substituent, An alkoxy group having 1 to 8 carbon atoms which may have a substituent; A halogen atom, An alkylcarbonylamino group having an alkyl group having 1 to 9 carbon atoms, and an alkylcarbonyl group containing an optionally substituted alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, A group selected from the group consisting of
  • the phenyl group contained in the linker has R 1 , R 2 and R 3 , one of which has a linker function and serves as a binding site with the 3 ′ end of the sense strand, Is characterized by forming a phosphodiester structure. The remaining two have no linker function and are merely substituents on the phenyl group.
  • L 1 is a single bond or a divalent oxygen atom —O—.
  • L 2 is a structure having a single bond or an amino group which may have a substituent on a methylene carbon atom. This amino group has a substituent R via a linker structure L 4 .
  • L 4 is a single bond, a methylene group or a polymethylene group having 2 to 4 carbon atoms, or a — (C ⁇ O) —CH 2 —CH 2 — (C ⁇ O) —O— structure. .
  • the carbonyl group of the structure — (C ⁇ O) —CH 2 —CH 2 — (C ⁇ O) —O— is bonded to the amino group at the left end of the structural formula, and —NH— (C ⁇ O) —CH 2
  • a structure of —CH 2 — (C ⁇ O) —O— is formed.
  • R is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • the alkyl group may be linear or branched. Examples thereof include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, an isobutyl group, a secondary butyl group, a pentyl group, and a hexyl group.
  • R is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, it may be linear or branched. Examples thereof include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, an isobutyl group, a secondary butyl group, a pentyl group, and a hexyl group.
  • R is a hydrocarbon carbonyl group having 2 to 30 carbon atoms which may be saturated or unsaturated (hydrocarbon group — (C ⁇ O) —), or the number of carbon atoms which may be saturated or unsaturated When it is a 2 to 30 hydrocarbon oxycarbonyl group (hydrocarbon group —O— (C ⁇ O) —), these hydrocarbon group moieties may be linear or branched.
  • the hydrocarbon group may be saturated, but may be unsaturated. Examples of such hydrocarbon groups include groups derived from aliphatic hydrocarbons. Examples of the hydrocarbon group include alkyl groups having up to 30 carbon atoms.
  • alkanes in which the carbon-carbon bond in the alkyl group is a double bond and becomes unsaturated may be used.
  • the hydrocarbon group portion may include an unsaturated bond and have a condensed cyclic structure.
  • a cholesteryl group can be mentioned as such a cyclic hydrocarbon group.
  • L 3 is a single bond or has a structure of — (C ⁇ O) —NH— or —NH— (C ⁇ O) —.
  • L 3 is bonded to L 2 at the left end and may be directly connected to the phenyl group shown in Chemical formula 8 in some cases.
  • L 3 is not a single bond, that is, when L 3 is — (C ⁇ O) —NH— or —NH— (C ⁇ O) —, a methylene group or polymethylene There is always a group. That is, in this case, n2 is not 0.
  • n1 1
  • n1 2 to 4
  • n1 2 to 4
  • n1 2 to 4
  • the dimethyleneoxy structure is preferably 2 or 3 repeats. That is, n1 is preferably 2 or 3. More preferably, there are two dimethyleneoxy structures, and n1 is more preferably 2.
  • a methylene group or up to 9 polymethylene groups are bonded to the right end of the dimethyleneoxy structure, but this methylene group or polymethylene group may not exist.
  • the methylene group or polymethylene group is preferably a polymethylene group.
  • the chain length is preferably 2 to 10 carbon atoms.
  • the polymethylene chain preferably has a long chain length, and is preferably a polymethylene chain having 5 or more carbon atoms. More preferably, it is a polymethylene chain having 7 or more carbon atoms.
  • the dimethyleneoxy structure and the methylene group or polymethylene group may be mixed, and in this case, the chain length may be about 2 to 10 atoms.
  • L 3 —O ⁇ is —CH (COOH) NH— (amino acid residue) j-Ser, —CH (COOH) NH Shows the structure of each of-(amino acid residue) j-Thr, -CH (NH 2 ) CO- (amino acid residue) j-Ser, or -CH (NH 2 ) CO- (amino acid residue) j-Thr .
  • Each structure is a polypeptide, but one end of the polypeptide may be tyrosine and the other end may be a hydroxyl group-containing amino acid.
  • the phenyl group of tyrosine is the binding site of the phosphodiester structure with the 5 'end
  • the hydroxyl group of the amino acid at the other end is the binding site of the phosphodiester structure with the 3' end.
  • the amino acid bonded to the 3 'end may be any amino acid containing a hydroxyl group, and may be serine or threonine.
  • the amino group of serine and threonine may be substituted with an acyl group.
  • This acyl group may be a phenylcarbonyl group or an alkylcarbonyl group.
  • the phenyl group of the phenylcarbonyl group may be substituted with an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a halogen atom, or the like.
  • the alkyl group of the alkylcarbonyl group may be an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and may be linear or branched, and further substituted with an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a halogen atom, or the like. May be.
  • acyl groups an alkylcarbonyl group is preferable, and an acetyl group is particularly preferable.
  • the structure of ⁇ -O-Ph-CH (COOH) NH- (amino acid residue) j-Ser is a structure in which serine or a polypeptide having serine terminal is bound to the amino group of tyrosine.
  • This peptide structure may form a polypeptide at the carboxy terminus of tyrosine, such as ⁇ O—Ph—CH (NH 2 ) CO— (amino acid residue) j-Ser.
  • the amino acids forming the polypeptide may be any of L-type, D-type, and DL-type.
  • the polypeptide may be a dipeptide to a tetrapeptide.
  • amino acid that binds between tyrosine and serine or threonine there are no particular restrictions on the amino acid that binds between tyrosine and serine or threonine, but glycine, alanine, ⁇ -alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, proline, histidine, arginine, lysine, cysteine, glutamine Any amino acid such as asparagine, serine, threonine, tyrosine, aspartic acid, glutamic acid may be used.
  • Preferable amino acids are glycine, alanine and ⁇ -alanine.
  • amino acids are glycine-glycine, glycine-alanine, glycine- ⁇ -alanine, alanine-glycine, alanine-alanine, alanine- ⁇ -alanine, ⁇ -alanine-glycine, ⁇ -alanine-alanine, ⁇ -alanine- ⁇ -alanine.
  • R 1 , R 2 and R 3 present on the phenyl group constituting the linker is -L 1- (CH 2 ) m -L 2 -L 3- (CH 2 CH 2 O) n1 — (CH 2 ) n2 —O ⁇ serves a linker function.
  • Two of R 1 , R 2 and R 3 are substituents on the phenyl group.
  • Examples of such a substituent include a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, an optionally substituted alkoxy group having 1 to 8 carbon atoms, a halogen atom, Any group selected from the group consisting of an alkylcarbonylamino group having an alkyl group having 1 to 9 carbon atoms and an alkylcarbonyl group containing an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms which may have a substituent. Good.
  • the alkyl group may be either linear or branched It may be. Examples thereof include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, an isobutyl group, a secondary butyl group, a pentyl group, a hexyl group, a heptyl group, and an octyl group.
  • examples of the substituent include a hydroxyl group, an amino group, a halogen atom, an alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a carboxy group, and an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms.
  • One or more groups selected from the group consisting of alkoxycarbonyl groups containing groups may be substituted. When there are one or more substituents, they may be the same or different.
  • the hydroxyl group or amino group is a substituent of an alkyl group, those substituted on the carbon atom at the terminal of the alkyl group are more preferable.
  • the alkyl group having a hydroxyl group is preferably a hydroxymethyl group, a 2-hydroxyethyl group, a 2-hydroxypropyl group, or a 3-hydroxypropyl group.
  • the alkyl group may be linear or branched having 1 to 6 carbon atoms, but more preferably has a halogen atom on a methyl group or an ethyl group In particular, a methyl group is preferable.
  • the halogen atom is an alkyl group substituent, the halogen atom is preferably a fluorine atom.
  • the number of fluorine atoms may be any from mono substitution to perfluoro substitution.
  • a monofluoromethyl group, a difluoromethyl group, a trifluoromethyl group, and a 2,2,2-trifluoroethyl group can be exemplified.
  • a monofluoromethyl group, a difluoromethyl group, and a trifluoromethyl group are preferred.
  • the alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms and the alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms may be linear or branched, for example, a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, A butyl group, an isobutyl group, a secondary butyl group, etc. can be mentioned.
  • alkoxycarbonyl group containing a carboxy group or an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms is a substituent of an alkyl group, those substituted on a carbon atom at the terminal of the alkyl group are more preferable.
  • the alkyl group of the alkoxycarbonyl group containing an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms may be linear or branched, for example, methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, butyl Group, isobutyl group, secondary butyl group and the like.
  • R 1 , R 2 and R 3 are an optionally substituted alkoxy group having 1 to 8 carbon atoms
  • the alkoxy group is an alkyl group, an oxygen atom, and Any alkoxy group may be used.
  • R 1 , R 2 and R 3 are halogen atoms, they may be fluorine atoms, chlorine atoms, bromine atoms or iodine atoms. Among these, a chlorine atom or a fluorine atom is preferable, and a fluorine atom is more preferable.
  • R 1 , R 2 and R 3 are alkylcarbonyl groups (aliphatic acyl groups) containing an optionally substituted alkyl group having 1 to 9 carbon atoms
  • the alkyl moiety is
  • the alkyl group may be any alkyl group having 9 to 9 carbon atoms including the above-described alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, and the alkylcarbonyl group may be composed of such an alkyl group and a carbonyl group.
  • an acetyl group is preferable.
  • R 1 , R 2 and R 3 , R 1 and R 3 are hydrogen atoms, and R 2 is —L 1 — (CH 2 ) m —L 2 —L 3 — (CH 2 CH 2 O) n1 —
  • R 2 is —L 1 — (CH 2 ) m —L 2 —L 3 — (CH 2 CH 2 O) n1 —
  • a linker structure represented by (CH 2 ) n2 —O ⁇ is preferred.
  • R 1 and R 3 are hydrogen atoms; A case where L 1 and L 2 are a single bond, L 3 is — (C ⁇ O) —NH—, and the sum of m and n 2 is an integer of 3 or more.
  • L 3 is — (C ⁇ O) —NH—, and the sum of m and n 2 is an integer of 8 or more.
  • L 3 is — (C ⁇ O) —NH—
  • m is 0 or 2
  • n 2 is an integer of 6 or more.
  • L 3 is — (C ⁇ O) —NH—
  • m is 0 or 2
  • n 2 is 6 or 8.
  • L 3 is — (C ⁇ O) —NH—
  • m is 0 or 2
  • n 2 is 8.
  • L 3 is — (C ⁇ O) —NH—
  • m is 2
  • n 2 is 8.
  • the antisense strand derived from the sense strand polynucleotide for the target gene and the antisense strand polynucleotide having a base sequence complementary to the sense strand polynucleotide is derived from the antisense strand.
  • nucleotide-3′-P ( ⁇ O) (OH)-[linker] -P ( ⁇ O) (OH) -5′-polynucleotide is also referred to as “3L5-polynucleotide”.
  • a polynucleotide having a structure represented by the following formula is preferable.
  • L 5 represents a single bond or —O—
  • L 6 represents — (C ⁇ O) —NH— or —NH— (C ⁇ O) — based on the bond with (CH 2 ) p
  • the bonding position on the benzene ring of L 5 is para-position or meta-position
  • p represents an integer of 1 to 4.
  • the sum of p and q is an integer of 3 or more, L 5 is a single bond, L 6 is — (C ⁇ O) —NH—, and the bonding position on the benzene ring of L 5 is the para position. If.
  • L 5 is a single bond
  • L 6 is — (C ⁇ O) —NH—
  • the bonding position on the benzene ring of L 5 is the para position. If.
  • L 5 is a single bond
  • L 6 is — (C ⁇ O) —NH—
  • the bond position on the benzene ring of L 5 is When in para position.
  • L 5 is a single bond
  • L 6 is — (C ⁇ O) —NH—
  • the bonding position of L 5 on the benzene ring is If it is a place.
  • L 5 is a single bond
  • L 6 is — (C ⁇ O) —NH—
  • the bonding position on the benzene ring of L 5 is the para position. If there is.
  • L 5 is a single bond
  • L 6 is — (C ⁇ O) —NH—
  • the bonding position on the benzene ring of L 5 is in the para position .
  • complementary nucleotide refers to a nucleotide in which the nucleotide base portion is complementary, for example, the base portion is adenine and thymine, guanine and cytosine, guanine and 5-methylcytosine and adenine. Nucleotides that are uracil are complementary nucleotides.
  • complementary nucleotide sequence refers to a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are complementary to a nucleotide sequence of interest in addition to a nucleotide sequence consisting entirely of complementary nucleotides. It also includes nucleotide sequences in which polynucleotides form base pairs.
  • the double-stranded structure of a polynucleotide has a double-stranded structure in which two mutually complementary nucleotide sequences of two polynucleotides form a Watson-Crick base pair. It also refers to those having a double-stranded structure inside a single-stranded polynucleotide in which complementary sequences within the single-stranded polynucleotide form Watson-Crick base pairs.
  • 3L5-polynucleotide in the present specification is a single-stranded polynucleotide in which complementary nucleotides form a Watson-Crick base pair to form a double-stranded structure, but all polynucleotides are Watson-Crick bases. It is not necessary to form a pair.
  • a passenger strand or sense strand for the target gene those containing the same nucleotide sequence as the target gene are referred to as a passenger strand or sense strand for the target gene and are complementary to the target gene.
  • Those containing a nucleotide sequence are called a guide strand or antisense strand for the target gene.
  • the antisense strand for the target gene has a nucleotide sequence complementary to the mRNA of the target gene.
  • the target gene “consisting of the same nucleotide sequence as the target gene” refers to consisting of the same sequence as the nucleotide sequence of at least a part of the target gene, in addition to the completely identical sequence, As long as the 3L5-polynucleotide has an RNA interference effect and / or a gene expression suppression effect on the target gene, it also includes a substantially identical sequence.
  • “Comprising a nucleotide sequence complementary to the target gene” refers to a sequence complementary to at least a part of the nucleotide sequence of the target gene, but in addition to the completely complementary sequence, the 3L5-polynucleotide The sequence includes substantially the same sequence as long as it has an RNA interference effect and / or a gene expression suppression effect on the target gene. In addition, when SNPs and the like are known as target genes, sequences having these mutations are also included in the same nucleotide sequence.
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to a target gene and having an RNA interference effect and / or gene expression suppression effect on the target gene is referred to as a polynucleotide for the target gene.
  • the nucleotide sequence of the 3L5-polynucleotide with respect to the target gene is not particularly limited as long as it has an RNA interference effect and / or gene expression suppression effect with respect to the target gene.
  • computer software for example, GENETYX (registered trademark): GENETYX COORPORATION
  • GENETYX registered trademark
  • GENETYX COORPORATION can be determined by determining the sequence of the sense strand and the antisense strand based on the sequence expected to have an RNA interference effect on the target gene, and based on the selected sequence. It can also be determined by confirming the RNA interference effect and / or the gene expression suppression effect of the 3L5-polynucleotide prepared above.
  • the gene expression suppressing action includes not only the action of completely suppressing the gene expression but also the action of decreasing the expression of the gene as compared to the control. Included in inhibitory action. Moreover, in this specification, gene expression inhibitory action and gene expression inhibitory activity are used interchangeably.
  • RNA interference action and / or the gene expression suppression action can be confirmed by a method commonly used by those skilled in the art.
  • the protein which is the translation product of the target gene after the lapse of time can be confirmed by quantifying the protein by Western blot analysis and comparing the expression level of the protein with the control. It can also be confirmed by measuring in real time the expression level of the target gene after administration of the single-stranded polynucleotide to the target gene by a real-time PCR technique.
  • the polynucleotide having the same or substantially the same sequence as the nucleotide sequence of at least a part of the target gene is the same or substantially the same as the sequence of 18 nucleotides or more which may be any part of the nucleotide sequence of the target gene. It is a polynucleotide consisting of such a sequence.
  • the “substantially identical sequence” refers to a sequence having a homology of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more with the nucleotide sequence of the target gene.
  • the homology of the nucleotide sequence can be calculated using known gene analysis software such as BLAST (registered trademark).
  • cm represents 2′-O-methylcytidine ( ⁇ 2> -O-methylcytidine) and “um” represents 2′-O in the ⁇ 223> item of each sequence.
  • -Methyluridine (2'-O-Methyluridine)
  • gm indicates 2'-O-methylguanosine (2'-O-Methylguanosine).
  • the length of the sense strand and the antisense strand constituting the 3L5-polynucleotide in the present invention is 18 nucleotides long as long as it has an RNA interference effect and / or a gene expression suppressing effect. Any length up to the full length of the frame (ORF) may be used.
  • the sense strand preferably has a chain length of 18 to 21, and more preferably has a chain length of 18 to 19.
  • the antisense strand preferably has a chain length of 19 to 21, more preferably 21 chains.
  • the 3L5-polynucleotide does not necessarily have a double-stranded structure as a whole, and includes those in which the 5 ′ and / or 3 ′ end partially protrudes, and the protruding end has 1 to 5 nucleotides, preferably 1 to 3 nucleotides. More preferably, it is 2 nucleotides.
  • the most preferred example is a polynucleotide having a structure in which the 3 ′ end of the polynucleotide of the antisense strand protrudes 2 nucleotides (overhang structure) and forms 18 base pairs.
  • the 3L5-polynucleotide has at least one property selected from the following (a) to (h).
  • A having an RNA interference effect and / or gene expression suppression effect on a target gene
  • B stable to RNase, and has an RNA interference effect and / or gene expression suppression effect on a target gene
  • C stable to phosphatase, having an RNA interference effect and / or gene expression suppression effect on a target gene
  • D stable to exonuclease, having RNA interference action and / or gene expression suppression action on the target gene
  • E It is stable against RNase, phosphatase and exonuclease, and has an RNA interference action and / or gene expression suppression action on a target gene
  • F the antisense strand is stable to phosphatase and has an RNA interference effect and / or gene expression suppression effect on the target gene
  • G the antisense strand is stable to exonuclease and has an RNA interference effect and / or or
  • 3L5-polynucleotide is derived from a double-stranded polynucleotide having a sense strand polynucleotide for a target gene and an antisense strand polynucleotide having a base sequence complementary to the sense strand polynucleotide.
  • the 5 ′ end of the strand and the 3 ′ end of the sense strand each have a structure in which a phosphodiester structure is formed and linked by a linker having a structure represented by the following structural formula.
  • polynucleotide-3 ′ Represents a structure having no hydrogen atom on the hydroxyl group at the 3 ′ end of the polynucleotide
  • 5′-polynucleotide is a polynucleotide.
  • a structure having no hydrogen atom on the hydroxyl group at the 5 ′ end of tide is shown.
  • a polynucleotide can be mentioned.
  • 3L5-polynucleotide is an RNA molecule having a sense strand and an antisense strand each having a length of 18 to 23 bases and having an isolated double-stranded structure, wherein each RNA strand has a length of 18 to 23. It has a base length and at least one strand has a 3 ′ overhang consisting of 1 to 3 bases, and the RNA molecule is capable of target-specific RNA interference, excluding the 3 ′ overhang.
  • RNA molecule wherein one strand of the RNA molecule consists of a sequence having 100% identity to a predetermined mRNA target molecule, and the mRNA target molecule is present in a cell or organism And a polynucleotide having a structure in which the 5 ′ end of the antisense strand and the 3 ′ end of the sense strand are joined by a linker that forms a phosphodiester structure in each. Rukoto can.
  • the sense strand polynucleotide is composed of a polynucleotide represented by the following formula (II)
  • the antisense strand polynucleotide is composed of a polynucleotide represented by the following formula (III):
  • Each of the 5 ′ end of the strand and the 3 ′ end of the sense strand is connected by a linker that forms a phosphodiester structure, and has the following characteristics (a) to (d) And polynucleotides or salts thereof: 5 '-( ⁇ - ⁇ ) 9 - ⁇ - ⁇ t -3' (II) 5'- ⁇ - ( ⁇ - ⁇ ) 9 - ⁇ u -3 '(III)
  • (B) t and u are the same or different and each represents an integer of 0 to 5;
  • ⁇ , ⁇ , ⁇ and ⁇ represent nucleoside units, and a line connecting each nucleoside represents a phosphodiester bond or a phosphorothioate bond.
  • the nucleoside unit is a N-glucosyl nucleobase such as the above-mentioned “natural nucleoside” or “sugar-modified nucleoside” and represents a structural unit of a polynucleotide.
  • the sense strand polynucleotide is composed of a polynucleotide represented by the following formula (IV)
  • the antisense strand polynucleotide is composed of a polynucleotide represented by the following formula (V):
  • Each of the 5 ′ end of the strand and the 3 ′ end of the sense strand is connected by a linker that forms a phosphodiester structure, and has the following characteristics (a) to (d) And polynucleotides or salts thereof: 5 ′-( ⁇ - ⁇ ) 9 - ⁇ p - ⁇ t -3 ′ (IV) 5'- ⁇ s- ( ⁇ - ⁇ ) 9 - ⁇ u -3 '(V) (A) ⁇ and ⁇ are differently selected from DNA or 2′-OMeRNA, ⁇ and ⁇ are the same or different and selected from DNA or 2′-OMeRNA, and ⁇ is the same or different from DNA,
  • ( ⁇ - ⁇ ) 9 - ⁇ p consists of the same nucleotide sequence as the target gene; Equation (d) in (IV) in ( ⁇ - ⁇ ) 9 and formula (V) ( ⁇ - ⁇ ) 9 consists complementary nucleotide sequences to one another.
  • ⁇ , ⁇ , ⁇ and ⁇ represent nucleoside units, and a line connecting each nucleoside represents a phosphodiester bond or a phosphorothioate bond.
  • the nucleoside unit is a N-glucosyl nucleobase such as the above-mentioned “natural nucleoside” or “sugar-modified nucleoside” and represents a structural unit of a polynucleotide.
  • the sense strand polynucleotide is composed of a polynucleotide represented by the following formula (VI)
  • the antisense strand polynucleotide is composed of a polynucleotide represented by the following formula (VII):
  • the 5 ′ end of the strand and the 3 ′ end of the sense strand each have a structure linked by a linker that forms a phosphodiester structure, and the features shown in the following (a) to (d) And a polynucleotide or a salt thereof.
  • ⁇ and ⁇ are differently selected from DNA or 2′-OMeRNA, ⁇ and ⁇ are the same or different and selected from DNA or 2′-OMeRNA, and ⁇ is the same or different from DNA, RNA, and 2′-OMeRNA Indicates any nucleotide;
  • p represents an integer of 0 or 1
  • t represents 0 when p is 0, and represents an integer of 0 to 5 when p is 1.
  • ⁇ - ( ⁇ - ⁇ ) 8 - ⁇ p consists of the same nucleotide sequence as the target gene; Equation (d) in ( ⁇ - ⁇ ) 8 and the formula (VII) in (VI) ( ⁇ - ⁇ ) 8 consists complementary nucleotide sequences to one another.
  • the sense strand polynucleotide is composed of a polynucleotide represented by the following formula (VIII)
  • the antisense strand polynucleotide is composed of a polynucleotide represented by the following formula (IX)
  • antisense Each of the 5 ′ end of the strand and the 3 ′ end of the sense strand has a structure linked by a linker that forms a phosphodiester structure, and has the following characteristics (a) to (c):
  • the polynucleotide or a salt thereof according to (1) having: 5 ′-( ⁇ - ⁇ ) 9 -3 ′ (VIII) 5'- ⁇ - ( ⁇ - ⁇ ) 9 - ( ⁇ - ⁇ ) -3 '(IX) (A) ⁇ is DNA and ⁇ is 2′-OMeRNA;
  • ⁇ - ( ⁇ - ⁇ ) 9 consists of the polynucleotide represented by the formula (IX)
  • 3L5-polynucleotides include those in which any 1 to 4 residues in 3L5-polynucleotide are substituted with other sugar-modified nucleotides as long as they have RNA interference and / or gene expression-suppressing effects.
  • Sugar modified nucleotides include all modes of sugar modification known in the technical field to which the present invention belongs.
  • Sugar-modified nucleotides can retain any heterocyclic base moiety and internucleoside linkage, and further include a group independent of the sugar modification.
  • the group of sugar modified nucleotides includes 2'-modified nucleosides, 4'-thio modified nucleosides, 4'-thio-2'-modified nucleosides and bicyclic sugar modified nucleosides.
  • Examples of 2′-modified nucleotides include halo, allyl, amino, azide, O-allyl, O—C 1 -C 10 alkyl, OCF 3 , O— (CH 2 ) 2 —O—CH 3 , 2′— O (CH 2 ) 2 SCH 3 , O— (CH 2 ) 2 —O—N (R m ) (R n ), or O—CH 2 —C ( ⁇ O) —N (R m ) (R n ) Wherein each R m and R n is independently H, an amino protecting group, or a substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl.
  • Preferred 2′-modifications are —F, —OCH 3 , or —O— (CH 2 ) 2 —O—CH 3 . More preferred is —OCH 3 .
  • 4′-thio-modified nucleosides include ⁇ -D-ribonucleosides in which the 4′-oxygen atom is replaced with a sulfur atom (Hoshika, S. et al. FEBS Lett. 579, p. 3115). -3118, (2005); Dande, P. et al. J. Med. Chem. 49, p. 1624-1634 (2006); Hoshika, S. et al. ChemBioChem. 8, p.2133-2138, (2007) )).
  • 4'-thio-2'-modified nucleosides examples include 2'-H or 4'-thio-2'-modified nucleosides that retain 2'-O-methyl (Matsugami, et al. al. Nucleic Acids Res. 36, 1805 (2008)).
  • bicyclic sugar-modified nucleosides include nucleosides that retain a second ring formed by bridging two atoms of the ribose ring, and examples of such nucleosides include 2′- 2 ', 4'-BNA / LNA (bridged nucleic acids / locked nucleic acids) (Obika, S. et al. Tetrahedron Lett., 38, p. 8735-) in which an oxygen atom and a 4'-carbon atom are bridged by a methylene chain. (1997) .; Obika, S. et al., Tetrahedron Lett., 39, p.5401- (1998) .; A.A.
  • sugar-modified nucleotides are the above-mentioned sugar-modified nucleotides, Same or different, ENA or 2 ′, 4′-BNA / LNA.
  • the 3L5-polynucleotide includes a polynucleotide in which 1 to 4 residues of DNA in the polynucleotide are the same or different and are substituted with RNA, ENA or 2 ', 4'-BNA / LNA.
  • the method for preparing the polynucleotide constituting the 3L5-polynucleotide is not particularly limited as long as the desired polynucleotide can be synthesized, but known chemical synthesis methods (phosphate triesters) Method, phosphoramidite method, H-phosphonate method, etc.). For example, it can synthesize
  • 3L5-polynucleotide As long as 3L5-polynucleotide can be synthesized, its production method is not limited. For example, it can be synthesized by the following method.
  • This step is a polymer support (1) to which a desired nucleoside is bonded (in the method A-1, represented as Tr 1 -O—Y-CPG.
  • Y represents a nucleoside unit in which the amino group of the nucleobase part is protected except for the 5′- and 3′-hydroxyl groups), and is an oligonucleotide analog comprising the desired nucleotide sequence compound
  • (2) is a step for preparing a (in method a, in. the formula expressed as HO-W 1 -Y-CPG, W 1 -Y is protected except for the 5'-end and 3'-terminal hydroxyl group Tr 1 represents a hydroxyl-protecting group).
  • Tr 1 is not particularly limited as long as it is a hydroxyl-protecting group that can be deprotected without removing the protecting group of the nucleic acid.
  • 4-methoxytrityl group, 4,4′-dimethoxytrityl group examples thereof include a pixyl group, a trityl group, a levulinyl group, and a bis (trimethylsilyloxy) (cyclohexyloxy) silyl group, and a 4-methoxytrityl group and a 4,4′-dimethoxytrityl group are preferable.
  • the protecting group for the amino group in the nucleobase is not particularly limited as long as it is usually used.
  • benzoyl group isobutyryl group, acetyl group, phenoxyacetyl group, 4- (t-butyl) phenoxyacetyl group , Allyloxycarbonyl group, and p-nitrophenylethylcarbonyl group.
  • CPGs include controlled pore glass, long chain alkylamino controlled pore glass (Oligonucleotide synthesis Synthesis by MJ Gait, IRL Press, 1984, pp84-115), polystyrene beads (Tetrahedron Lett. 94, 34). ) And the like. In this case, those having an aminoalkyl group such as an aminopropyl group or aminohexyl group on the polymer support can be mentioned.
  • a linker capable of binding to the polynucleotide As a linker capable of binding to the polynucleotide, —OC ( ⁇ O) —CH 2 CH 2 C ( ⁇ O) —, which is ester-bonded to the 3 ′ position of Y via succinic acid via an oxygen atom, is used. And the other carboxylic acid of succinic acid includes those having an amide bond with an amino group on the polymer support.
  • succinic acid sarcosine (—OC ( ⁇ O) —CH 2 CH 2 C ( ⁇ O) —), oxalic acid linker (—OC ( ⁇ O) C ( ⁇ O) —) and the like can be mentioned.
  • Tr 1 O—Y—CPG, where Tr 1 is a 4,4′-dimethoxytrityl group, and CPG uses succinic acid via an oxygen atom to the 3 ′ position of Y.
  • An ester-linked —OC ( ⁇ O) —CH 2 CH 2 C ( ⁇ O) — is used, and the other carboxylic acid of succinic acid is an amide bond with an amino group on the polymer support. Examples include 2'-OMe-A-RNA-CPG (20-3600-10), 2'-OMe-C-RNA-CPG (20-3610-10), 2'-OMe-G- from Glen Research.
  • RNA-CPG (20-3621-10), 2′-OMe-U-RNA-CPG (20-3630-10), Bz-A-RNA-CPG (20-3303-10), Ac-C-RNA- CPG (20-3315-1 ), IPr-Pac-G-RNA-CPG (20-3324-10), U-RNA-CPG (20-3330-10), dA-CPG (20-2000-10), dC-CPG (20-2010) -10) dG-CPG (20-2020-10), dT-CPG (20-2030-10), and the like.
  • Compound (2) is produced by a normal phosphoramidite method using an automatic DNA synthesizer using a phosphoramidite reagent or the like necessary for producing compound (2).
  • Oligonucleotide analogs having a desired nucleotide sequence can be prepared in accordance with the method described in the literature (Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984)) using a DNA synthesizer, for example, model 392 using the phosphoramidite method of PerkinElmer. Can be synthesized.
  • oligonucleotide analog when the oligonucleotide analog is thioated, tetraethylthiuram disulfide (TETD, Applied Biosystems), Beaucage reagent, phenylacetyl disulfide / pyridine-acetonitrile (1: 1 v / v) solution (1: 1 v / v) Ravikumar, V.T. et al., Bioorg.Med.Chem.Lett. (2006) 16, p.2513-2517), etc., using literature (Tetahedron Letters, 32, 3005 (1991), J. Am. Chem. Soc., 112, 1253 (1990)), a thioate derivative can be obtained.
  • TETD tetraethylthiuram disulfide
  • Beaucage reagent phenylacetyl disulfide / pyridine-acetonitrile
  • Step C-1 This step comprises protecting the compound (9) in an inert solvent in the presence of a deoxidizer under acidic conditions (preferably dimethoxytrityl chloride). ) To obtain a compound (10) in which the hydroxyl group of the compound (9) is protected.
  • a deoxidizer under acidic conditions (preferably dimethoxytrityl chloride).
  • the solvent to be used is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction and dissolves the starting material to some extent, but aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene and xylene; halogens such as methylene chloride and chloroform Hydrocarbons; ethers such as ether, tetrahydrofuran, dioxane and dimethoxyethane; amides such as dimethylformamide, dimethylacetamide and hexamethylphosphorotriamide; sulfoxides such as dimethylsulfoxide; acetone, methyl ethyl ketone and the like Ketones: heterocyclic amines such as pyridine or nitriles such as acetonitrile can be mentioned, and heterocyclic amines (particularly pyridine) are preferred.
  • aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene and xylene
  • halogens such as methylene chloride and chloroform Hydrocarbons
  • Examples of the protecting reagent used include trityl halides such as trityl chloride, monomethoxytrityl chloride, dimethoxytrityl chloride, and trimethoxytrityl chloride, and monomethoxytrityl chloride and dimethoxytrityl chloride are preferable.
  • the deoxidizer used is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction and does not decompose the product and the starting material, but aromatic amines such as pyridine and dimethylaminopyridine are preferable.
  • reaction temperature and reaction time vary depending on the type of protecting reagent and deoxidizing agent used, but dimethoxytrityl chloride is used as the protecting reagent, and pyridine is used as a solvent and deoxidizing agent at room temperature. 2 hours.
  • the target compound is collected from the reaction mixture according to a conventional method.
  • the reaction mixture is appropriately neutralized, and if insoluble matter is present, it is removed by filtration, water and an immiscible organic solvent such as ethyl acetate are added, and after washing with water, the organic layer containing the target compound is removed. After separating and drying over anhydrous magnesium sulfate or the like, the solvent is distilled off. If necessary, the obtained target compound can be further purified by a conventional method such as recrystallization, reprecipitation or chromatography.
  • Step C-2 the compound (11) having an amide bond is reacted with a phenol having an amino group at the carboxyl group of the compound (10) in an inert solvent. It is a process of forming.
  • the solvent used is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene, xylene; methylene chloride, chloroform, carbon tetrachloride, dichloroethane, chlorobenzene, dichlorobenzene Halogenated hydrocarbons such as: ethyl formate, ethyl acetate, propyl acetate, butyl acetate, esters such as diethyl carbonate, ketones such as acetone, methyl ethyl ketone methyl isobutyl ketone, isophorone, cyclohexanone; nitroethane, nitrobenzene, etc.
  • aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene, xylene; methylene chloride, chloroform, carbon tetrachloride, dichloroethane, chlorobenzene, dichlorobenzene
  • Nitro compounds acetonitrile, nitriles such as isobutyronitrile; amides such as formamide, dimethylformamide (DMF), dimethylacetamide, hexamethylphosphorotriamide; dimethylsulfoxide De, sulfoxides such as sulfolane and the like, preferably halogenated hydrocarbons (particularly methylene chloride) are amides (particularly dimethylformamide).
  • amides such as formamide, dimethylformamide (DMF), dimethylacetamide, hexamethylphosphorotriamide
  • dimethylsulfoxide De sulfoxides such as sulfolane and the like, preferably halogenated hydrocarbons (particularly methylene chloride) are amides (particularly dimethylformamide).
  • phenol used examples include 4-aminophenol and 3-aminophenol, and 4-aminophenol is preferred.
  • amide forming reagents used include N-hydroxy compounds such as N-hydroxysuccinimide, 1-hydroxybenzotriazole, N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide; Diimidazole compounds such as' -oxalyldiimidazole, N, N'-carbonyldiimidazole; disulfide compounds such as 2,2'-dipyridyldisulfide; N, N'-disuccinimidyl carbonate Succinic acid compounds such as; phosphinic chloride compounds such as N, N′-bis (2-oxo-3-oxazolidinyl) phosphinic chloride; N, N′-disuccinimidyl oxalate (DSO) N, N-diphtal imidyl oxalate (DPO), N, N′-bis ( Rubornenyl succinimidyl) oxalate (BNO), 1,1'-bis (benzotride
  • HOBT 1-Hydroxybenzotriazole
  • reaction temperature and reaction time vary depending on the type of amide-forming reagent and solvent used, but are 0 to 100 ° C. for 5 to 50 hours, particularly room temperature when 4-aminophenol and EDC are used in methylene chloride. 18 hours.
  • the target compound is collected from the reaction mixture according to a conventional method.
  • the reaction mixture is appropriately neutralized, and if insoluble matter is present, it is removed by filtration, water and an immiscible organic solvent such as ethyl acetate are added, and after washing with water, the organic layer containing the target compound is removed. After separating and drying over anhydrous magnesium sulfate or the like, the solvent is distilled off. If necessary, the obtained target compound can be further purified by a conventional method such as recrystallization, reprecipitation or chromatography.
  • Method D An overview of Method D is shown in FIG.
  • n1, n2, m, and L 1 are the same as described above.
  • m represents an integer of 0 to 4
  • L 1 represents a single bond or —O—.
  • Step D-1a the compound (13a) having an amide bond is reacted with a phenol having a carboxyl group at the amino group of the compound (12a) in an inert solvent. It is a process of forming.
  • the phenols used include 3-hydroxyphenylacetic acid, 4-hydroxyphenylacetic acid, 3- (3-hydroxyphenyl) propionic acid, 3- (4-hydroxyphenyl) propionic acid, 4- (3-hydroxyphenyl) Examples include valeric acid, 4- (4-hydroxyphenyl) valeric acid, 3-hydroxyphenoxyacetic acid, 4-hydroxyphenoxyacetic acid, and the like is preferably 3- (4-hydroxyphenyl) propionic acid.
  • This step can be performed in the same manner as in step C-2.
  • Step D-2a In this step, a protecting reagent (preferably dimethoxytrityl chloride) that can be removed under acidic conditions in the presence of a deoxidizing agent is added to compound (13a) in an inert solvent. ) To obtain a compound (14a) in which the hydroxyl group of the compound (13a) is protected.
  • a protecting reagent preferably dimethoxytrityl chloride
  • This step can be performed in the same manner as in step C-1.
  • Step D-1b In this step, compound (13b) having an amide bond is reacted with phenol having a carboxyl group at the amino group of compound (12b) in an inert solvent. It is a process of forming.
  • the phenols used include 3-hydroxyphenylacetic acid, 4-hydroxyphenylacetic acid, 3- (3-hydroxyphenyl) propionic acid, 3- (4-hydroxyphenyl) propionic acid, 4- (3-hydroxyphenyl) Examples include valeric acid, 4- (4-hydroxyphenyl) valeric acid, 3-hydroxyphenoxyacetic acid, 4-hydroxyphenoxyacetic acid, and the like is preferably 3- (4-hydroxyphenyl) propionic acid.
  • This step can be performed in the same manner as in step C-2.
  • Step D-2b This step comprises protecting the compound (13b) in an inert solvent in the presence of a deoxidizer under acidic conditions (preferably dimethoxytrityl chloride). ) To obtain a compound (14b) in which the hydroxyl group of the compound (13b) is protected.
  • a deoxidizer under acidic conditions (preferably dimethoxytrityl chloride).
  • This step can be performed in the same manner as in step C-1.
  • Step D-1c the amino group of the compound (12a) is reacted with a phenol having a carboxyl group in an inert solvent to give the compound (13c) having an amide bond. It is a process of forming.
  • phenol used examples include N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy) carbonyl] -L-tyrosine.
  • This step can be performed in the same manner as in step C-2.
  • Step D-2c This step comprises protecting the compound (13c) in an inert solvent in the presence of a deoxidizer under acidic conditions (preferably dimethoxytrityl chloride). ) To obtain a compound (14c) in which the hydroxyl group of the compound (13c) is protected.
  • a deoxidizer under acidic conditions (preferably dimethoxytrityl chloride).
  • This step can be performed in the same manner as in step C-1.
  • Step E-1 In this step, a protecting reagent (preferably monomethoxytrityl) that can be removed under acidic conditions in the presence of a deoxidizer in compound (15) in an inert solvent.
  • Chloride is a step of obtaining a compound (16) in which the hydroxyl group of the compound (15) is protected.
  • This step can be performed in the same manner as in step C-1.
  • Step E-2 This step is a step of reacting the carboxyl group of compound (16) with a tyrosine ester in an inert solvent to form compound (17) having an amide bond.
  • tyrosine ester examples include tyrosine methyl ester and tyrosine ethyl ester, and tyrosine ethyl ester is preferable.
  • This step can be performed in the same manner as in step C-2.
  • Method F The outline of Method F is shown in Fig. 3.
  • A represents —CH 2 —, —CH (CH 3 ) —, —CH 2 CH 2 —, —CH [CH 2 CH (CH 3 ) 2 ] —, and —CH [CH (CH 3 ) CH 2 CH 3 ] —.
  • Step F-1 This step involves reacting the amino group of compound (18) with an amino acid (19) protected with a t-Boc group in an inert solvent to form an amide bond.
  • Examples of the type of amino acid protected with a t-Boc group include glycine, alanine, ⁇ -alanine, leucine, and isoleucine, with glycine, alanine, and ⁇ -alanine being preferred.
  • This step can be performed in the same manner as in step C-2.
  • Step 2-3-5 F-2 In this step, compound (20) is reacted with a deprotecting reagent in an inert solvent to selectively remove the protecting group of amino group, and then compound (21 ).
  • the solvent used is preferably an aromatic hydrocarbon such as benzene, toluene or xylene; a halogenated hydrocarbon such as methylene chloride, chloroform, carbon tetrachloride, dichloroethane, chlorobenzene or dichlorobenzene; formic acid Esters such as ethyl, ethyl acetate, propyl acetate, butyl acetate, diethyl carbonate; ethers such as diethyl ether, diisopropyl ether, tetrahydrofuran, dioxane, dimethoxyethane, diethylene glycol dimethyl ether; methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, such as n-butanol, isobutanol, t-butanol, isoamyl alcohol, diethylene glycol, glycerin, octanol, cyclohexanol
  • Ketones such as acetone, methyl ethyl ketone, methyl isobutyl ketone, isophorone and cyclohexanone; nitro compounds such as nitroethane and nitrobenzene; nitriles such as acetonitrile and isobutyronitrile; formamide, dimethylformamide, dimethylacetamide, Amides such as hexamethylphosphorotriamide; sulfoxides such as dimethyl sulfoxide and sulfolane, and more preferably alcohols (particularly methanol, ethanol), methylene chloride, and acetic acid as a deprotecting reagent Is a mixture of acetic acid and water.
  • the deprotecting reagent to be used is not particularly limited as long as it is usually used.
  • the protecting group is a t-Boc group
  • acetic acid, dichloroacetic acid, trifluoroacetic acid, hydrochloric acid and bromide examples include Lewis acids such as zinc, and acetic acid, dichloroacetic acid, and trifluoroacetic acid are preferable.
  • the reaction temperature varies depending on the reagent, raw material, solvent, etc. used, but is usually ⁇ 10 to 100 ° C., preferably 0 to 50 ° C.
  • the reaction time varies depending on the raw materials used, the solvent, the reaction temperature, etc., but is usually 1 minute to 50 hours, preferably 1 minute to 24 hours.
  • the target compound is collected from the reaction mixture according to a conventional method.
  • Step F-3 This step is a step in which an amino group of compound (21) is reacted with compound (16) in an inert solvent to form compound (22) having an amide bond. is there.
  • This step can be performed in the same manner as in step C-2.
  • FIG. 4 shows an overview of the G method.
  • Step G-1 This step consists of compound (11) produced in step C-2, compound (14a) produced in step D-2a, and compound produced in step D-2b. (14b), the compound (14c) produced in the D-2c step, the compound (17) produced in the E-2 step, and the phenol of the compound (22) produced in the F-3 step (in FIG. 4) , Tr—O—X—H, where Tr represents a hydroxyl-protecting group), and mono-substituted chloro (alkoxy) phosphines (in FIG.
  • Tr is not particularly limited as long as it is a hydroxyl-protecting group that can be deprotected without removing the protecting group of the nucleic acid.
  • 4-methoxytrityl group, 4,4′-dimethoxytrityl group, pixyl Group, a trityl group, a levulinyl group, and a bis (trimethylsilyloxy) (cyclohexyloxy) silyl group and a 4-methoxytrityl group and a 4,4′-dimethoxytrityl group are preferable.
  • the solvent used is not particularly limited as long as it does not affect the reaction, but preferably ethers such as tetrahydrofuran, diethyl ether, dioxane; methylene chloride, chloroform, carbon tetrachloride, dichloroethane. , Halogenated hydrocarbons such as chlorobenzene and dichlorobenzene.
  • R 4 in this step includes a 2-cyanoethyl group, a methyl group, a methanesulfonylethyl group, a 2,2,2-trichloroethyl group, and an allyl group, preferably a cyanoethyl group and a methyl group.
  • R 5 in this step can include a morpholino group, a diisopropylamino group, a diethylamino group, and a dimethylamino group, and is preferably a diisopropylamino group.
  • Examples of mono-substituted chloro (alkoxy) phosphines used include chloro (morpholino) methoxyphosphine, chloro (morpholino) cyanoethoxyphosphine, chloro (dimethylamino) methoxyphosphine, chloro (dimethylamino) cyanoethoxyphosphine, chloro
  • Examples include phosphines such as (diisopropylamino) methoxyphosphine and chloro (diisopropylamino) cyanoethoxyphosphine, preferably chloro (morpholino) methoxyphosphine, chloro (morpholino) cyanoethoxyphosphine, chloro (diisopropylamino) methoxyphosphine. Chloro (diisopropylamino) cyanoethoxyphosphine.
  • a deoxidizing agent is used, and in this case, the deoxidizing agent used is a heterocyclic amine such as pyridine, dimethylaminopyridine, trimethylamine, Aliphatic amines such as triethylamine and diisopropylethylamine are exemplified, but aliphatic amines (particularly diisopropylethylamine) are preferred.
  • a heterocyclic amine such as pyridine, dimethylaminopyridine, trimethylamine
  • Aliphatic amines such as triethylamine and diisopropylethylamine are exemplified, but aliphatic amines (particularly diisopropylethylamine) are preferred.
  • di-substituted-alkoxyphosphines examples include bis (diisopropylamino) cyanoethoxyphosphine, bis (diethylamino) methanesulfonylethoxyphosphine, bis (diisopropylamino) (2,2,2-trichloroethoxy) phosphine, and bis Examples thereof include phosphines such as (diisopropylamino) (4-chlorophenylmethoxy) phosphine, and bis (diisopropylamino) cyanoethoxyphosphine is preferable.
  • an acid is used.
  • the acid used is preferably tetrazole, acetic acid or p-toluenesulfonic acid.
  • the reaction temperature is not particularly limited, but is usually 0 to 80 ° C., preferably room temperature.
  • the reaction time varies depending on the raw materials used, reagents, temperature, etc., but is usually 5 minutes to 30 hours, and preferably 30 minutes to 10 hours when reacted at room temperature.
  • the target compound (7) of this reaction for example, neutralizes the reaction mixture as appropriate, and if insolubles are present, it is removed by filtration and then immiscible with water and ethyl acetate. It is obtained by adding an organic solvent, washing with water, separating the organic layer containing the target compound, drying over anhydrous magnesium sulfate and the like, and then distilling off the solvent.
  • the obtained target compound can be further purified by a conventional method such as recrystallization, reprecipitation or chromatography.
  • Step G-2 the compound (23) produced by G-1 is converted to the compound (2) produced by A-1 by a conventional phosphoroprotein using an automatic DNA synthesizer.
  • compound (24) is produced by the amidite method (in the figure, W 2 represents a protected sense strand polynucleotide excluding the 5′-end and 3′-end hydroxyl groups, and W 1 -Y represents: Represents a protected antisense strand polynucleotide excluding 5 ′ and 3 ′ terminal hydroxyl groups, and Tr 1 represents a hydroxyl protecting group).
  • Tr 1 is not particularly limited as long as it is a hydroxyl-protecting group that can be deprotected without removing the protecting group of the nucleic acid.
  • 4-methoxytrityl group, 4,4′-dimethoxytrityl group examples thereof include a pixyl group, a trityl group, a levulinyl group, and a bis (trimethylsilyloxy) (cyclohexyloxy) silyl group, and a 4-methoxytrityl group and a 4,4′-dimethoxytrityl group are preferable.
  • Compound (24) is produced by an ordinary phosphoramidite method using an automatic DNA synthesizer.
  • Oligonucleotide analogs having a desired nucleotide sequence can be prepared in accordance with the method described in the literature (Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984)) using a DNA synthesizer, for example, model 392 using the phosphoramidite method of PerkinElmer. Can be synthesized.
  • oligonucleotide analog when the oligonucleotide analog is thioated, tetraethylthiuram disulfide (TETD, Applied Biosystems), Beaucage reagent, phenylacetyl disulfide / pyridine-acetonitrile (1: 1 v / v) solution (1: 1 v / v) Ravikumar, V.T. et al., Bioorg.Med.Chem.Lett. (2006) 16, p.2513-2517), etc., using literature (Tetahedron Letters, 32, 3005 (1991), J. Am. Chem. Soc., 112, 1253 (1990)), a thioate derivative can be obtained.
  • TETD tetraethylthiuram disulfide
  • Beaucage reagent phenylacetyl disulfide / pyridine-acetonitrile
  • Step G-3 This step is a step of producing the final compound (25) by cutting out from the CPG of the compound (24) produced by G-2, removing the protecting group (
  • W 2 ′ represents a sense strand polynucleotide excluding 5′-end and 3′-end hydroxyl groups
  • W 1 ′ -Y ′ represents 5′-end and 3′-end hydroxyl groups. Represents excluded antisense strand polynucleotides.).
  • the reaction temperature is not particularly limited, but is usually ⁇ 50 to 80 ° C., preferably room temperature to 60 ° C.
  • the reaction time varies depending on the raw material, reagent, temperature, etc. used, but is usually 5 minutes to 30 hours, and preferably 5 hours when reacted at 60 ° C.
  • Tr 1 When the compound obtained by distilling off the solvent after completion of the reaction is bound to Tr 1 , various chromatographies such as reverse phase chromatography, ion exchange chromatography (including high performance liquid chromatography), etc. It can be purified by a purification operation.
  • Tr 1 When Tr 1 is not deprotected under basic conditions, for example, 4-methoxytrityl group, 4,4′-dimethoxytrityl group, pixyl group, trityl group, etc., acidic conditions of the same method as in step F-2 are used. Tr 1 can be deprotected. Preferred is 80% aqueous acetic acid.
  • the reaction mixture containing the compound (25) thus obtained is purified for use in usual nucleic acid purification, such as various types of chromatography such as reverse phase chromatography and ion exchange chromatography (including high performance liquid chromatography).
  • the compound (25) can be obtained by purification by operation.
  • This method makes it possible to obtain 3L5-polynucleotide and double-stranded polynucleotides in which the phosphate at the 3 'end of the sense strand and the 5' end of the antisense strand are not modified.
  • the 3L5-polynucleotide is a 3L5-polynucleotide obtained by introducing a cholesterol unit, a lipid unit, or a vitamin E unit (for example, Lorenz, C. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett., 14, p. 4975). -4977 (2004); Southschek, J., et al. Nature, 432, p.173-178, (2004); Wolfrum, C. et al. Nature Biotech. 25, p.1149-1157, (2007)) Kubo, T. Et al. Oligonucleotides, 17, p. 1-20, (2007); Kubo, T. , Et al. Biochem. Biophys. Res. Comm.
  • aptamer that is a nucleic acid molecule that binds to a protein, at the end of 3L5-polynucleotide.
  • 3L5-polynucleotide includes those in which 3L5-polynucleotide is bound to a monoclonal antibody (or an appropriate binding portion thereof) or a protein (or an appropriate oligopeptide fragment thereof) (for example, Song, et al. Nature Biotech). 23, p.709-717 (2005); see Xia et al. Pharm.Res 24, p.2309-2316 (2007), Kumar, et al. Nature, 448, p.39-43 (2007). ).
  • 3L5-polynucleotides include those that have a positively charged complex by adding a cationic polymer to 3L5-polynucleotide (examples of distribution to organs and cells can be achieved).
  • a cationic polymer to 3L5-polynucleotide.
  • 3L5-polynucleotide includes all pharmaceutically acceptable salts, esters, or salts of such esters of the 3L5-polynucleotide.
  • the pharmaceutically acceptable salts of 3L5-polynucleotide are preferably alkali metal salts such as sodium salt, potassium salt and lithium salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt, aluminum salt, Metal salts such as iron salt, zinc salt, copper salt, nickel salt, cobalt salt; inorganic salt such as ammonium salt, t-octylamine salt, dibenzylamine salt, morpholine salt, glucosamine salt, phenylglycine alkyl ester salt, Ethylenediamine salt, N-methylglucamine salt, guanidine salt, diethylamine salt, triethylamine salt, dicyclohexylamine salt, N, N'-dibenzylethylenediamine salt, chloroprocaine salt, procaine salt, diethanolamine salt, N-benzyl-phenethylamine salt, Piperazine salt, tetrame Amine salts such as organic salts such as ru
  • compositions containing 3L5-polynucleotides may include other molecules, molecular structures, or other formulations such as liposomes, receptor targeting molecules, oral, rectal, topical or other formulations to assist in uptake, distribution and / or absorption. Encapsulated, conjugated, mixed with a mixture of compounds.
  • the polynucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof can be used as such or as an appropriate pharmacologically acceptable salt. It is mixed with dosage forms, diluents, etc. and administered orally by tablets, capsules, granules, powders, syrups, etc., or parenterally by injections, suppositories, patches, external preparations, etc. can do.
  • excipients eg sugar derivatives such as lactose, sucrose, sucrose, mannitol, sorbitol; starch derivatives such as corn starch, potato starch, alpha starch, dextrin; cellulose derivatives such as crystalline cellulose; Gum arabic; dextran; organic excipients such as pullulan; and silicate derivatives such as light anhydrous silicic acid, synthetic aluminum silicate, calcium silicate and magnesium metasilicate aluminate; phosphates such as calcium hydrogen phosphate; Carbonates such as calcium; inorganic excipients such as sulfates such as calcium sulfate; and lubricants (eg, stearic acid, calcium stearate, metal stearate such as magnesium stearate) Salt; Talc; Colloidal silica; Bead wax Waxes such as gay wax; boric acid; adipic acid; sulfate such as sodium sulfate; glycol;
  • the target gene is RNA in the cell.
  • An introducer means a cell, tissue, or individual.
  • the cells for which 3L5-polynucleotide is used include germline cells, somatic cells, totipotent cells, multipotent cells, dividing cells, non-dividing cells, parenchyma cells, epithelial cells, immortalized cells, transformed cells Any of nerve cells or immune cells may be used.
  • tissues include single-cell embryos or constitutive cells, multi-cell embryos, fetal tissues, and the like.
  • the differentiated cells include fat cells, fibroblasts, muscle cells, cardiomyocytes, endothelial cells, neurons, glia, blood cells, megakaryocytes, lymphocytes, macrophages, neutrophils, eosinophils, Examples include basophils, mast cells, leukocytes, granulocytes, keratinocytes, chondrocytes, osteoblasts, osteoclasts, hepatocytes, and endocrine or exocrine gland cells. Examples of such cells include CHO-K1 cells (RIKEN Cell bank), Drosophila S2 cells (Schneider, l.
  • Human HeLa cells (ATCC: CCL-2) or human HEK293 cells (ATCC: CRL-1573) are preferably used.
  • 3L5-polynucleotide recipients include those belonging to plants, animals, protozoa, viruses, bacteria, or fungi.
  • the plant may be a monocotyledonous plant, a dicotyledonous plant or a gymnosperm, and the animal may be a vertebrate or an invertebrate.
  • the vertebrates are preferably mammals including mice, rats, monkeys, dogs and humans.
  • 3L5-polynucleotide As a method for introducing 3L5-polynucleotide into the recipient, when the recipient is a cell or tissue, the calcium phosphate method, electroporation method, lipofection method, virus infection, 3L5-polynucleotide solution Immersion or transformation methods are used. Examples of the method for introduction into an embryo include microinjection, electroporation, and viral infection.
  • the introducer is a plant, a method by injection or perfusion into the body cavity or stromal cells of the plant or spraying is used.
  • an electroporation method or virus infection is used.
  • a method for oral introduction a method in which 3L5-polynucleotide is directly mixed with biological food can also be used.
  • a colloidal dispersion system can be used for the method of introducing 3L5-polynucleotide into a patient.
  • the colloidal dispersion system is expected to have an effect of increasing the stability of the compound in the living body and an effect of efficiently transporting the compound to a specific organ, tissue or cell.
  • Colloidal dispersions are not limited as long as they are commonly used, but are based on lipids including polymer complexes, nanocapsules, microspheres, beads, and oil-in-water emulsifiers, micelles, mixed micelles and liposomes. Dispersed systems can be mentioned, and are preferably a plurality of liposomes and artificial membrane vesicles that have an effect of efficiently transporting a compound to a specific organ, tissue or cell (Manno et al., Biotechniques, 1988). Blue and Cevc, Biochem. Et Biophys. Acta, 1990, 1029, p. 91-; Lapalainen et al., Anti-Res., 1994, 23, p. 119-; Chonn and Cullis, Curr nt Op.Biotech., 1995,6, p.698-).
  • Unilamellar liposomes having a size range of 0.2-0.4 ⁇ m can encapsulate a significant proportion of aqueous buffer containing macromolecules, and the compound is encapsulated in this aqueous inner membrane and biologically It is transported to brain cells in an active form (Fraley et al., Trends Biochem. Sci., 1981, 6, p. 77-).
  • composition of liposomes is usually a complex of lipids, especially phospholipids, especially phospholipids with a high phase transition temperature, usually combined with one or more steroids, especially cholesterol.
  • lipids useful for liposome production include phosphatidyl compounds such as phosphatidylglycerol, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, sphingolipid, phosphatidylethanolamine, cerebroside and ganglioside.
  • phosphatidyl compounds such as phosphatidylglycerol, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, sphingolipid, phosphatidylethanolamine, cerebroside and ganglioside.
  • diacylphosphatidylglycerol where the lipid moiety contains 14-18 carbon atoms, in particular 16-18 carbon atoms, and is saturated (double bonds within the 14-18 carbon atom chain). Is missing).
  • Representative phospholipids include phosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine and distearoylphosphatidylcholine.
  • Targeting of colloidal dispersions including liposomes can be either passive or active.
  • Passive targeting is achieved by taking advantage of the inherent tendency of liposomes to be distributed to the reticuloendothelial cells of organs containing sinusoidal capillaries.
  • active targeting includes, for example, viral protein coat (Morishita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1993, 90, p. 8474-), monoclonal antibody (Or appropriate binding moieties thereof), specific ligands such as sugars, glycolipids or proteins (or appropriate oligopeptide fragments thereof) are bound to liposomes, or organs and cells other than naturally occurring localized sites
  • viral protein coat Moishita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1993, 90, p. 8474-
  • monoclonal antibody Or appropriate binding moieties thereof
  • specific ligands such as sugars, glycolipids or proteins (or appropriate oligopeptide fragments thereof) are bound to liposomes, or organs and cells other than naturally occurring localized sites
  • a method of modifying the liposome by changing the composition of the liposome can be exemplified.
  • the surface of the targeted colloidal dispersion can be modified in various ways.
  • lipid groups can be incorporated into the lipid bilayer of the liposome in order to maintain the target ligand in close association with the lipid bilayer.
  • a variety of linking groups can be used to link the lipid chain to the target ligand.
  • Target ligands that bind to specific cell surface molecules found predominantly on cells where delivery of 3L5-polynucleotide is desired include, for example: (1) specifics that are predominantly expressed by the cells where delivery is desired A hormone, growth factor or suitable oligopeptide fragment thereof, or (2) a polyclonal or monoclonal antibody that specifically binds to an antigenic epitope predominantly found on the target cell, Or a suitable fragment thereof (eg, Fab; F (ab ′) 2).
  • Two or more bioactive agents can be complexed and administered within a single liposome.
  • the amount of 3L5-polynucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof varies depending on symptoms, age, etc., but in the case of oral administration, the lower limit is 1 mg (preferably 30 mg) and the upper limit is 2000 mg (preferably 1500 mg), in the case of intravenous administration or subcutaneous administration, a lower limit of 0.5 mg (preferably 5 mg), an upper limit of 500 mg (preferably 250 mg) per dose, and in the case of intratracheal administration The lower limit is 0.5 mg (preferably 5 mg) and the upper limit is 500 mg (preferably 250 mg) per dose. In the case of intraocular administration, the lower limit is 0.05 mg (preferably 0.5 mg).
  • an upper limit of 10 mg is desirably administered to adults 1 to 3 times per day depending on symptoms.
  • a drug with improved stability it is desirable to administer 1 to 3 times a week, and in the case of a drug with further improved stability, it is desirable to administer 1 to 3 times a month according to the symptoms.
  • compositions and formulations for topical administration include transdermal patches, ointments, lotions, creams, gels, wrinkles, suppositories, sprays, liquids and powders.
  • Example 14 When 2′-O, 4′-C-ethylene nucleoside phosphoramidite is used, Example 14 (5′-O-dimethoxytrityl-2′-O, 4′-C-ethylene-6- N-benzoyladenosine-3′-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropyl) phosphoramidite), Example 27 (5′-O-dimethoxytrityl-2′-O, 4′-C-ethylene-2) -N-isobutyrylguanosine-3'-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropyl) phosphoramidite), Example 22 (5'-O-dimethoxytrityl-2'-O, 4'-C- Ethylene-4-N-benzoyl-5-methylcytidine-3′-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropyl) phosphoramidite), Example 9 (5′-O-dimethoxytr
  • Phospholink manufactured by ABI was appropriately prepared and used.
  • the phosphoramidite was appropriately attached to an automatic nucleic acid synthesizer to synthesize a polynucleotide having a desired sequence.
  • the indicated polynucleotide was synthesized using 0.5 ⁇ mol of CPG (Controlled Pore Glass; manufactured by Applied Biosystems or manufactured by Glen Research) to which a desired nucleoside was bound as a solid phase carrier.
  • CPG Controlled Pore Glass
  • a desired nucleoside was bound as a solid phase carrier.
  • acid treatment was not performed (dimethoxytrityl group was bonded on the oligonucleotide).
  • CT-437 was synthesized in the same manner as in Reference Example 1.
  • the X amidite reagent prepared as follows was coupled to the X portion.
  • the compound (20 mg) obtained in Reference Example 3 is dissolved in 2 mL of acetonitrile: methylene chloride (1: 1 v / v), and 2-cyanethyltetraphosphopropylamide (74 ⁇ L, 0.23 mmol), 360 ⁇ L of 1H tetrazole 0.45 M acetonitrile solution is added. Stir for 2 hours. After confirming the progress of the reaction by TLC, filter filtration was performed to prepare an X amidite reagent.
  • the structure of CT-437 is shown in FIG.
  • the amidite reagent for the X moiety was prepared using the compound (20 mg) obtained in Reference Example 4.
  • CT-455 the nucleotide at the 3 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and the nucleotide at the 5 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 are bound to X via a phosphodiester bond. Polynucleotide.
  • the structure of CT-455 is shown in FIG.
  • CT-456 the nucleotide at the 3 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and the nucleotide at the 5 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 are bound to X through a phosphodiester bond. Polynucleotide.
  • the structure of CT-456 is shown in FIG.
  • CT-446 the nucleotide at the 3 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing and the nucleotide at the 5 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 are bound to X via a phosphodiester bond. Polynucleotide.
  • the structure of CT-446 is shown in FIG.
  • CT-447 the nucleotide at the 3 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing and the nucleotide at the 5 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 are bound to X via a phosphodiester bond. Polynucleotide.
  • the structure of CT-447 is shown in FIG.
  • CT-448 the nucleotide at the 3 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and the nucleotide at the 5 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 bind to X through a phosphodiester bond. Polynucleotide.
  • the structure of CT-448 is shown in FIG.
  • CT-449 the nucleotide at the 3 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and the nucleotide at the 5 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 are bound to X through a phosphodiester bond. Polynucleotide.
  • the structure of CT-449 is shown in FIG.
  • CT-450 the 3 ′ terminal nucleotide of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and the 5 ′ terminal nucleotide of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 bind to X through a phosphodiester bond. Polynucleotide.
  • the structure of CT-450 is shown in FIG.
  • CT-451 the nucleotide at the 3 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and the nucleotide at the 5 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 bind to X through a phosphodiester bond. Polynucleotide.
  • the structure of CT-451 is shown in FIG.
  • CT-452 the nucleotide at the 3 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and the nucleotide at the 5 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 are bound to X through a phosphodiester bond. Polynucleotide.
  • the structure of CT-452 is shown in FIG.
  • CT-453 the nucleotide at the 3 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and the nucleotide at the 5 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 are bound to X through a phosphodiester bond. Polynucleotide.
  • the structure of CT-453 is shown in FIG.
  • CT-454 the 3 ′ terminal nucleotide of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and the 5 ′ terminal nucleotide of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 bind to X through a phosphodiester bond. Polynucleotide.
  • the structure of CT-454 is shown in FIG.
  • CT-460 the nucleotide at the 3 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and the nucleotide at the 5 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 bind to X through a phosphodiester bond. Polynucleotide.
  • the structure of CT-460 is shown in FIG.
  • CT-461 the nucleotide at the 3 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and the nucleotide at the 5 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 bind to X through a phosphodiester bond. Polynucleotide.
  • the structure of CT-461 is shown in FIG.
  • CT-462 the nucleotide at the 3 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and the nucleotide at the 5 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 bind to X through a phosphodiester bond. Polynucleotide.
  • the structure of CT-462 is shown in FIG.
  • CT-463 the 3 ′ terminal nucleotide of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing and the 5 ′ terminal nucleotide of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 bind to X through a phosphodiester bond. Polynucleotide.
  • the structure of CT-463 is shown in FIG.
  • CT-464 the nucleotide at the 3 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and the nucleotide at the 5 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 are bound to X via a phosphodiester bond. Polynucleotide.
  • the structure of CT-464 is shown in FIG.
  • CT-465 the 3 ′ terminal nucleotide of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and the 5 ′ terminal nucleotide of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 bind to X through a phosphodiester bond. Polynucleotide.
  • the structure of CT-465 is shown in FIG.
  • CT-466 the 3 ′ terminal nucleotide of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing and the 5 ′ terminal nucleotide of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 bind to X through a phosphodiester bond. Polynucleotide.
  • the structure of CT-466 is shown in FIG.
  • CT-467 the nucleotide at the 3 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and the nucleotide at the 5 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 bind to X through a phosphodiester bond. Polynucleotide.
  • the structure of CT-467 is shown in FIG.
  • CT-468 the nucleotide at the 3 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and the nucleotide at the 5 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 bind to X through a phosphodiester bond. Polynucleotide.
  • the structure of CT-468 is shown in FIG.
  • CT-469 the nucleotide at the 3 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing and the nucleotide at the 5 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 are bound to X through a phosphodiester bond. Polynucleotide.
  • the structure of CT-469 is shown in FIG.
  • CT-470 the 3 ′ terminal nucleotide of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing and the 5 ′ terminal nucleotide of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 bind to X through a phosphodiester bond. Polynucleotide.
  • the structure of CT-470 is shown in FIG.
  • CT-471 the 3 ′ terminal nucleotide of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and the 5 ′ terminal nucleotide of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 bind to X through a phosphodiester bond. Polynucleotide.
  • the structure of CT-471 is shown in FIG.
  • CT-472 the nucleotide at the 3 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 3 of the sequence listing and the nucleotide at the 5 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 4 are bound to X through a phosphodiester bond. Polynucleotide.
  • the structure of CT-472 is shown in FIG.
  • CT-473 the 3 ′ terminal nucleotide of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 5 of the sequence listing and the 5 ′ terminal nucleotide of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 6 bind to X through a phosphodiester bond. Polynucleotide.
  • the structure of CT-473 is shown in FIG.
  • Table 1 shows the structure and molecular weight of the X portion of the polynucleotides described in Examples 1 to 16.
  • the methylene group at the end of X is bonded to the 3 ′ end of the sense strand polynucleotide to form a phosphodiester bond
  • the oxygen atom bonded to the phenyl group is at the 5 ′ end of the antisense strand polynucleotide.
  • Table 2 shows the structure and molecular weight of the X moiety of the polynucleotides described in Examples 17 to 26.
  • the methylene group at the end of X is bonded to the 3 ′ end of the sense strand polynucleotide to form a phosphodiester bond
  • the oxygen atom bonded to the phenyl group is at the 5 ′ end of the antisense strand polynucleotide.
  • CT- 157 was synthesized.
  • the structure of CT-157 is shown in FIG. Base sequence: Contains a sequence complementary to nucleotide numbers 3139-3157 of the human ⁇ -catenin gene (GenBank accession No. NM — 001004.3).
  • the oligomer was excised from the support by treating the protected polynucleotide analog having the target sequence with 2 mL of ammonia water: ethanol solution (3: 1 v / v) at 55 ° C. for 16 hours, and the phosphate group The cyanoethyl group of the protecting group and the protecting group on the nucleobase were removed. CPG was removed by filtration, washed with ethanol, combined with the filtrate and the washing solution, and the solvent was distilled off under reduced pressure. To the remaining residue, 0.3 mL of triethylamine trihydrofluoride was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 19 hours and then purified.
  • the structure of CT-106 is shown in FIG.
  • Base sequence Contains the sequence of nucleotide numbers 3139-3157 of the human ⁇ -catenin gene (GenBank accession No. NM_001904.3).
  • Base sequence Contains a sequence complementary to nucleotide numbers 3139-3157 of the human ⁇ -catenin gene (GenBank accession No. NM — 001004.3).
  • CT-001 HO-G rp -C m1p -A rp -C m1p -A rp -A m1p -G rp -A m1p -A rp -U m1p -G rp -G m1p -A rp -U m1p -C rp -A m1p - Synthesis of C rp -A m1p -A rp -T p -T t -H (SEQ ID NO: 9 in Sequence Listing) (CT-001) CT-001 was synthesized in the same manner as in Reference Example 32.
  • CT-001 The structure of CT-001 is shown in FIG.
  • Molecular weight Calculated value: 6894.46, measured value: 6850.8
  • Base sequence Contains the sequence of nucleotide numbers 3139-3157 of the human ⁇ -catenin gene (GenBank accession No. NM_001904.3).
  • CT-005 HO-U m1p ⁇ U rp ⁇ G m1p ⁇ U rp ⁇ G m1p ⁇ A rp ⁇ U m1p ⁇ C rp ⁇ C m1p ⁇ A rp ⁇ U m1p ⁇ U rp ⁇ C m1p ⁇ U rp ⁇ U m1p ⁇ G rp ⁇ Synthesis of U m1p -G rp -C m1p -T p -T t -H (SEQ ID NO: 10 of Sequence Listing) (CT-005) CT-005 was synthesized in the same manner as in Reference Example 32.
  • CT-005 The structure of CT-005 is shown in FIG.
  • FIG. 5 shows the structures of the compounds described in Reference Examples 3 to 14, 17 and 21 to 23, and
  • FIG. 10 shows the structures of the compounds described in Reference Examples 24 to 31.
  • Example 27 Annealing for forming a double-stranded structure
  • 300 pmol each of sense strand and antisense strand were put into one tube, dried under reduced pressure, and 30 ⁇ L of siRNA suspension buffer (QIAGEN) was added, heated at 65 ° C. for 1 minute, and then allowed to stand at room temperature for 5 minutes to anneal the sense strand and the antisense strand to obtain a 10 ⁇ M double-stranded polynucleotide solution.
  • siRNA suspension buffer QIAGEN
  • a double-stranded polynucleotide may be represented only by a combination of a sense strand and an antisense strand. That is, for example, a double-stranded polynucleotide comprising a combination of CT-169 / CT-157 is also simply expressed as “CT169 / CT157” or “CT169 / 157”. )
  • CT169 / CT157 CT-169 / CT157
  • CT169 / 157 CT169 / CT157
  • Test Example 1 The strength of the human ⁇ -catenin gene expression inhibitory activity of single-stranded or double-stranded polynucleotides was compared as follows.
  • Lipofection reagent Lipofectamine RNAiMAX (manufactured by Invitrogen) in 7.5 ⁇ L, single-stranded or double-stranded polynucleotide solution in OPTI-MEM medium to a final concentration of 0.3, 0.03, and 0.003 nM And left at room temperature for 20 minutes. The mixed solution was added to each well, and the culture was further continued for 3 days.
  • human ⁇ -catenin gene PCR primer (primer set ID: HA135664, manufactured by Takara Bio Inc.), and PCR primer for human-GAPDH gene as an internal standard (primer set ID: HA067812, manufactured by Takara Bio Inc.)
  • mRNA was quantified as follows using a real-time PCR kit (manufactured by QIAGEN) containing drugs necessary for PCR.
  • (3) Real-time PCR analysis (a) Gene suppression activity analysis 1 CT-169 / CT-157, CT-437, CT-455, CT-456, CT-446, CT-447, CT-448, CT-449, CT-450, CT-451, CT-452, CT- The ⁇ -catenin gene expression inhibitory activity of 453, CT-454, and CT-461 (see FIGS. 6 and 7 for the structure) was examined.
  • CT-437, CT-455, CT-456, CT-446, CT-447, CT-448, CT-449, CT-450, CT-451, CT-452, CT-453 CT-454 and CT-461 strongly suppressed the expression of the ⁇ -catenin gene in the same manner as CT-169 / CT-157.
  • CT-448 and CT-454 showed stronger activity than CT-169 / CT-157. This indicates that a single-stranded polynucleotide in which the antisense strand 5 'end and the sense strand 3' end are linked via a phosphate group using a modified phenyl group has a strong gene expression suppressing activity.
  • Test Example 2 As in Test Example 1, the strength of the human ⁇ -catenin gene expression inhibitory activity of the single-stranded or double-stranded polynucleotide was compared.
  • Real-time PCR analysis a) Gene suppression activity analysis 1 The ⁇ -catenin gene expression inhibitory activity of CT-169 / CT-157, CT-460, CT-461, CT-462, and CT-463 (see FIG. 7 for the structure) was examined.
  • CT-460, CT-461, CT-462, and CT-463 strongly suppressed the expression of the ⁇ -catenin gene than CT-169 / CT-157. This indicates that a single-stranded polynucleotide in which the antisense strand 5 'end and the sense strand 3' end are bound via a phosphate group using a modified phenyl group has a strong gene expression suppressing activity.
  • the lipofection reagent Lipofectamine RNAiMAX (manufactured by Invitrogen) is 7.5 ⁇ L, and the single-stranded or double-stranded polynucleotide solution is OPTI ⁇ so that the final concentrations are 0.3, 0.03, and 0.003 nM.
  • (2) Real-time PCR The same method as in Test Example 1 was performed.
  • CT-470 strongly suppressed the expression of the ⁇ -catenin gene, like CT-169 / CT-157.
  • CT-448, CT-454, CT-464, CT-465, CT-466, CT-467, CT-468, CT-469, and CT-471 are more active than CT-169 / CT-157 showed that.
  • Gene suppression activity analysis 2 The ⁇ -catenin gene expression inhibitory activity of CT-106 / CT-041 and CT-472 (see FIG.
  • CT-472 strongly suppressed the expression of the ⁇ -catenin gene in the same manner as CT-106 / CT-041. This indicates that a single-stranded polynucleotide in which the antisense strand 5 ′ end and the sense strand 3 ′ end are bonded via a phosphate group using a modified phenyl group has strong gene expression-inhibiting activity.
  • Gene suppression activity analysis 4 The ⁇ -catenin gene expression inhibitory activity of CT-001 / CT-005 and CT-473 (see FIG. 13 for the structure) was examined. As shown in FIG. 14, CT-473 suppressed the expression of ⁇ -catenin gene more strongly than CT-001 / CT-005.
  • PK-009 the nucleotide at the 3 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 17 of the sequence listing and the nucleotide at the 5 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 18 are linked via a phosphodiester bond to X. Polynucleotide.
  • the structure of PK-009 is shown in FIG.
  • HS-005 the 3 ′ terminal nucleotide of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 23 of the sequence listing and the 5 ′ terminal nucleotide of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 24 bind to X through a phosphodiester bond. Polynucleotide.
  • the structure of HS-005 is shown in FIG.
  • HS-006 the nucleotide at the 3 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 25 of the sequence listing and the nucleotide at the 5 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 26 bind to X through a phosphodiester bond. Polynucleotide.
  • the structure of HS-006 is shown in FIG.
  • the amidite reagent for the X moiety was prepared using the compound (20 mg) obtained in Reference Example 14.
  • the phosphorothioate binding moiety was prepared by treating with a 0.2 M phenylacetyl disulfide / pyridine-acetonitrile (1: 1 v / v) solution for 3 minutes.
  • HS-005s the 3 ′ terminal nucleotide of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 27 of the sequence listing and the 5 ′ terminal nucleotide of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 28 bind to X through a phosphodiester bond. Polynucleotide.
  • the structure of HS-005s is shown in FIG.
  • the amidite reagent for the X moiety was prepared using the compound (20 mg) obtained in Reference Example 14.
  • the phosphorothioate binding moiety was prepared by treating with a 0.2 M phenylacetyl disulfide / pyridine-acetonitrile (1: 1 v / v) solution for 3 minutes.
  • HS-006s the nucleotide at the 3 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 29 of the sequence listing and the nucleotide at the 5 ′ end of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 30 bind to X through a phosphodiester bond. Polynucleotide.
  • the structure of HS-006s is shown in FIG.
  • HS-012 binds to the 3 ′ terminal nucleotide of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 33 of the sequence listing and the 5 ′ terminal nucleotide of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 34 via a phosphodiester bond with X. Polynucleotide. The structure of HS-012 is shown in FIG.
  • Table 3 shows the structure and molecular weight of the X portion of the polynucleotides described in Examples 27 to 32.
  • the methylene group at the end of X is bonded to the 3 ′ end of the sense strand polynucleotide to form a phosphodiester bond
  • the oxygen atom bonded to the phenyl group is at the 5 ′ end of the antisense strand polynucleotide.
  • Molecular weight calculated value: 6658.04, measured value: 6658.23
  • Base sequence Contains the sequence of nucleotide numbers 743-762 of the RNA-dependent protein kinase gene (GenBank accession No. NM_011163).
  • Base sequence Contains a sequence complementary to nucleotide numbers 743 to 762 of the RNA-dependent protein kinase gene (GenBank accession No. NM — 011163).
  • the structure of the antisense strand of HS-001 is shown in FIG. Molecular weight: calculated value: 6567.00, measured value: 6566.99
  • the single-stranded or double-stranded polynucleotide shown in FIG. 15 can be introduced into the Mouse embryonic fibroblast using the lipofection reagent Lipofectamine RNAiMAX (manufactured by Invitrogen).
  • the expression level of the PKR gene and 36B4 gene as an internal standard are measured by a quantitative PCR system (Applied Biosystems) using SYBR Green.
  • the rat NRK-52E cell line was prepared at a concentration of 62,500 cells / mL in Dulbecco's modified Eagle's medium (Invitrogen) containing 10% Fetal bovine serum. Then, 1 mL was seeded in each well of the plate containing the liposome-polynucleotide diluted solution, and cultured under conditions of 37 ° C. and 5% carbon dioxide.
  • Dulbecco's modified Eagle's medium Invitrogen
  • ribosomal RNA The expression level of ribosomal RNA (rRNA) of the same sample as an internal standard was measured.
  • TaqMan Ribosomal RNA Control Reagents VIC TM Probe manufactured by Applied Biosystems, catalog number: 4308329 was used as a primer and probe for rRNA measurement.
  • FIG. 17 shows the average of the results of three independent experiments and its S.P. D. The values are shown (the structure of the polynucleotide and its nucleotide sequence are shown in FIG. 16).
  • HS-012 strongly suppressed the expression of rat Hsp47 gene equivalently or better than siHSP47C. This indicates that a single-stranded polynucleotide in which the antisense strand 5 ′ end and the sense strand 3 ′ end are linked via a phosphate group using a modified phenyl group is stronger in gene expression suppression activity than the double-stranded polynucleotide. It has shown that.
  • a single-stranded polynucleotide having an RNA interference effect and / or a gene expression suppression effect could be provided.
  • the single-stranded polynucleotide can be used for gene function analysis, pharmaceuticals and the like, but the industrial field is not limited as long as the single-stranded polynucleotide can be used.
  • SEQ ID NO: 1 CT-169 SEQ ID NO: 2: CT-157 SEQ ID NO: 3: sense strand region of CT-472 SEQ ID NO: 4: antisense strand region of CT-472 SEQ ID NO: 5: sense strand region of CT-473 SEQ ID NO: 6: antisense strand region of CT-473 SEQ ID NO: 7 CT-106 SEQ ID NO: 8: CT-041 SEQ ID NO: 9: CT-001 SEQ ID NO: 10: CT-005 SEQ ID NO: 11: ⁇ -catenin gene forward primer SEQ ID NO: 12: ⁇ -catenin gene reverse primer SEQ ID NO: 13: GAPDH gene forward primer SEQ ID NO: 14: GAPDH gene reverse primer SEQ ID NO: 15: PK-001 SEQ ID NO: 16: PK-002 SEQ ID NO: 17: PK-009 sense strand region SEQ ID NO: 18: PK-009 antisense strand region SEQ ID NO: 19: HS-001 sense strand SEQ

Abstract

ＲＮＡ分解酵素に安定な、ＲＮＡ干渉作用を有するポリヌクレオチド等を提供すること。　標的遺伝子に対するセンス鎖ポリヌクレオチド、及び該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有する２本鎖ポリヌクレオチドを由来とし、このアンチセンス鎖の５'末端およびセンス鎖の３'末端が、各々においてリン酸ジエステル構造を形成したフェニル基を含有するリンカーによって結合されている構造を有する１本鎖ポリヌクレオチド。

Description

修飾１本鎖ポリヌクレオチド
　本発明はＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する１本鎖ポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドの使用、該ポリヌクレオチドを用いた遺伝子発現抑制方法、該ポリヌクレオチドを含有する医薬等に関する。
　細胞、組織、あるいは個体内の標的遺伝子の発現を阻害する方法として、当該細胞、組織、あるいは個体内に２本鎖ＲＮＡを導入する手法がある。２本鎖ＲＮＡの導入によって、その配列に相同性を持つｍＲＮＡが分解され、標的遺伝子の発現が阻害される。この効果は「ＲＮＡ干渉」又は「ＲＮＡｉ」と呼ばれている。ＲＮＡ干渉は最初に線虫で報告され（例えば、非特許文献１参照。）、その後に植物でも報告されている（例えば、非特許文献２参照。）。
　３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを有する、センス鎖、アンチセンス鎖それぞれ２１ヌクレオチドからなる２本鎖ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ：ｓｉＲＮＡ）は、脊椎動物の培養細胞において、ＲＮＡ干渉作用を有することが報告されている（例えば、非特許文献３参照。）。ｓｉＲＮＡは遺伝子機能の同定、有用物質生産に適した細胞株のスクリーニング、疾患に関与する遺伝子の制御等に有用であるとされているが、ＲＮＡ分解酵素によって容易に分解されるという性質を有する（例えば、非特許文献４参照。）。
　ＲＮＡ分解酵素に対して安定なＲＮＡ干渉作用を有する２本鎖ポリヌクレオチドとしては、ｓｉＲＮＡを構成するＲＮＡの代わりにＤＮＡ及び２’－ＯＭｅＲＮＡを交互に組み合わせたヌクレオチドユニットを有する２本鎖ポリヌクレオチドが報告されている（特許文献１参照）。
　ｓｉＲＮＡのセンス鎖、アンチセンス鎖の５’末端の修飾に関しては、幾つかの報告がある。センス鎖、又は、アンチセンス鎖の５’末端に６－アミノヘキシルリン酸基を有するｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ発現抑制活性があると報告されている（例えば、非特許文献５参照。）。一方、アンチセンス鎖の５’末端に同じ６－アミノヘキシルリン酸基を有するｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ発現抑制活性がないと報告されている（例えば、非特許文献６参照。）。また、センス鎖の５’末端に３－アミノプロピルリン酸基を有するｓｉＲＮＡは標的ｍＲＮＡ発現抑制活性があるが、アンチセンス鎖の５’末端に３－アミノプロピルリン酸基を有するｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ発現抑制活性がないと報告されている（例えば、非特許文献７参照。）。アンチセンス鎖の５’末端に同様の６－アミノヘキシルリン酸基又は３－アミノプロピルリン酸基を有するｓｉＲＮＡは、未修飾ｓｉＲＮＡと比較し、標的ｍＲＮＡ発現抑制活性の低下が見られるが完全に活性が失われるものでないと報告されている（例えば、非特許文献８参照。）。
　センス鎖又はアンチセンス鎖の５’末端にフルオレセインを有するｓｉＲＮＡにおいても標的ｍＲＮＡ発現抑制活性を有すると報告されている（例えば、非特許文献９参照。）。センス鎖又はアンチセンス鎖の５’末端にステロイド又は脂質の構造を有するｓｉＲＮＡにおいて、センス鎖の５’末端にステロイド又は脂質の構造を有するｓｉＲＮＡでは、標的ｍＲＮＡの発現を抑制する活性を有すると報告されている（例えば、非特許文献８参照。）。ＵＶ照射により脱離することができるオルトニトロベンジル誘導体をアンチセンス鎖の５’末端に有する場合、ＵＶ照射を用いて標的ｍＲＮＡ発現抑制する活性を制御できると報告している（例えば、非特許文献１０参照。）。
　センス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端を、４つ程度のヌクレオチドユニットからなるループで結合したsiRNAは、１本鎖ポリヌクレオチドになり、short hairpin RNA（ｓｈRNA)と呼ばれている。ステム部分が１９塩基対であるｓｈRNAは、それと同じ塩基配列を有する１９塩基対のsiRNAと比較して、活性が低下することが示されている（例えば、非特許文献９参照。）。また、ループ内の２つのヌクレオチドをプロピルリン酸ユニットなどの非ヌクレオチドリンカーで置き換えた１９塩基対のステムからなるｓｈＲＮＡが合成され、標的mRNA発現抑制活性が測定されたが、未修飾shRNAと比較して活性の向上は認められていない（例えば、非特許文献９参照。）。センス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端を非ヌクレオチドリンカーで結合したsiRNAとして、オルトニトロベンジル誘導体を用いた例がある（例えば、非特許文献８参照。）。このオルトニトロベンジル誘導体で結合した１９塩基対のsiRNAは、未修飾siRNAと比較して標的mRNA発現抑制活性が低下している。さらに、このsiRNAをトランスフェクトした培養細胞に１０分間UV照射し、標的mRNA発現抑制活性が測定されたが、未修飾siRNAと比較して標的mRNA発現抑制活性が低下している。アンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端が、各々においてリン酸ジエステル構造を形成したフェニル基を含有するリンカーによって結合されている構造を有する１本鎖ポリヌクレオチドは知られていない。
　ＲＮＡｉ活性に関与することが知られているＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質（Ａｇｏ）とアンチセンス鎖の複合体Ｘ線解析から、アンチセンス鎖の５’末端のリン酸基及びその近傍のヌクレオチドがＡｇｏのＰＩＷＩドメインに強く結合していることが示されている（例えば、非特許文献１１参照。）。化学合成したｓｉＲＮＡを細胞内へ導入すると、センス鎖とアンチセンス鎖の両方の５’末端がリン酸化されることが報告されている（例えば、非特許文献１２参照。）。ヒトの細胞においては、ＲＮＡキナーゼ　ｈＣｌｐ１がｓｉＲＮＡの５’－リン酸化を担っていることが報告されている（例えば、非特許文献１３参照。）。５’末端をリン酸化したｓｉＲＮＡと、５’末端をリン酸化していないｓｉＲＮＡを細胞内に導入しＲＮＡｉ活性を比較すると、両者の活性に差が見られなかったことから、５’末端非リン酸化ｓｉＲＮＡは細胞内で容易にリン酸化を受けると考えられている（例えば、非特許文献９参照。）。
　センス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端がループで結合したｓｈRNAを用いた場合は、細胞内でDicer若しくはエンドヌクレアーゼによって切断され、５’末端のリン酸基を有するアンチセンス鎖が生成する（例えば、非特許文献９参照。）。ループ内の２つのヌクレオチドをプロピルリン酸ユニットで置き換えた１９塩基対のステムからなるｓｈＲＮＡでは、プロピルリン酸ユニットがヌクレアーゼ耐性であるために、細胞内でDicer若しくはエンドヌクレアーゼによる切断が期待できない（例えば、非特許文献９参照。）。また、オルトニトロベンジル誘導体をループに持つ１９塩基対のshRNAは、UV照射により５’末端のリン酸基を有するアンチセンス鎖が生成することが期待できるが、副作用の懸念や生体内部への送達を考慮すると、UV照射を生体へ応用することが困難である（例えば、非特許文献８参照。）。UV照射することなく、細胞内でDicer若しくはエンドヌクレアーゼによって切断されて５’末端のリン酸基を有するアンチセンス鎖が生成し、非ヌクレオチドのみからなるリンカーをループに持ち、１９塩基対以下のステムからなる１本鎖ポリヌクレオチドは知られていない。
　本発明者らは、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有するポリヌクレオチドを取得すべく、鋭意研究を行ったところ、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する、標的遺伝子に対するセンス鎖ポリヌクレオチド、及び該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有する２本鎖ポリヌクレオチドを由来とし、このアンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端が、各々においてリン酸ジエステル構造を形成したフェニル基を含有するリンカーによって結合されている構造を有する１本鎖ポリヌクレオチドを見出し、本発明を完成させた。
国際公開第２０１０／００１９０９号パンフレット
Ｎａｔｕｒｅ、１９９８年、第３９１巻、ｐ．８０６－８１１ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年、第２８６巻、ｐ．９５０－９５２ Ｎａｔｕｒｅ、２００１年、第４１１巻、ｐ．４９４－４９８ Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００２年、第４８巻、ｐ．１６４７－１６５３ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｅｌｌ、２００２年、第１０巻、ｐ．５３７－５４８ Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００３年、第３１巻、ｐ．２７０５－２７１６ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｅｌｌ、２００２年、第１０巻、ｐ．５４９－５６１ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、２００７年、第１７巻、ｐ．３５－４３ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２００３年、第１３巻、ｐ．８３－１０５ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ、２００６年、第１７５８巻、ｐ．　３９４－４０３ Ｎａｔｕｒｅ，２００５年、第４３４巻、ｐ．６６３－６６６ Ｃｅｌｌ、２００１年、第１０７巻、ｐ．３０９－３２１ Ｎａｔｕｒｅ、２００７年、第４４７巻、ｐ．２２２－２２６
　本発明の一つの課題は、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有するポリヌクレオチドを提供することである。
　本発明の一つの課題は、ＲＮＡ分解酵素に安定なＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有するポリヌクレオチドを提供することである。
　本発明の他の一つの課題は上記ポリヌクレオチドによって遺伝子発現を抑制する方法を提供することである。
　本発明の他の一つの課題は上記ポリヌクレオチドを含有する医薬品を提供することである。
　すなわち、本発明は、
（１）標的遺伝子に対するセンス鎖ポリヌクレオチド、及び該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有するポリヌクレオチドであって、該アンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端と該センス鎖ポリヌクレオチドの３’末端の各々において、リン酸ジエステル構造を形成している次式で示される構造のリンカーによって結合されたポリヌクレオチド又はその塩
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
式中、
フェニル基に結合している酸素原子は、アンチセンス鎖の５’末端に結合してリン酸ジエステル構造を形成し、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のいずれか１個は、次式で示される構造：
－Ｌ１－（ＣＨ２）ｍ－Ｌ２－Ｌ３－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）n1－（ＣＨ２）n2－Ｏ→
を示すが、式中、
ｍは、０から４の整数を示し、
ｎ1は、０から４の整数を示し、
ｎ2は、０又は２から１０の整数を示し、
Ｌ１は、単結合又は－Ｏ－を示し、
Ｌ２は、単結合又は－ＣＨ（－ＮＨ－Ｌ４－Ｒ）－を示し、
Ｌ３は、Ｌ２との結合を基点として、単結合、－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＨ－、又は－ＮＨ－（Ｃ＝Ｏ）－を示すが、
Ｌ３が単結合以外のとき、ｎ2は、２から１０の整数を示す。
Ｌ１及びＬ２が単結合であって、ｍが１、ｎ1およびｎ2が０であるときに、Ｌ３－Ｏ→は、
－ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ－（アミノ酸残基）ｊ－Ｓｅｒ、
－ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ－（アミノ酸残基）ｊ－Ｔｈｒ、
－ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ－（アミノ酸残基）ｊ－Ｓｅｒ、又は
－ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ－（アミノ酸残基）ｊ－Ｔｈｒ、
を示すが、これらのセリンおよびトレオニンの水酸基部分は、センス鎖ポリヌクレオチドの３’末端のリン酸基と結合しており、さらにセリンおよびトレオニンのアミノ基はアシル基で置換されていてもよく、
ｊは、０から２の整数を示し、
Ｌ４は、単結合、－（Ｃ＝Ｏ）－（ＣＨ２）ｋ－ＮＨ－、又は－（Ｃ＝Ｏ）－（ＣＨ２）ｋ－を示し、
ｋは１から６の整数を示し、
Ｒは、水素原子、炭素数１から６のアルキル基、飽和又は不飽和であってもよい炭素数２から３０の炭化水素カルボニル基、飽和又は不飽和であってもよい炭素数２から３０の炭化水素オキシカルボニル基を示す。
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のうちの残りの２個は、各々独立に、
水素原子、
置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルキル基、
置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルコキシ基、
ハロゲン原子、
炭素数１から９のアルキル基を有するアルキルカルボニルアミノ基、及び
置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルキル基を含むアルキルカルボニル基、
からなる群の基から選ばれる基を示す、

（２）Ｒ１及びＲ３が水素原子である、（１）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（３）Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、ｍとｎ2の和が３以上の整数である、（２）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（４）Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、ｍとｎ2の和が８以上の整数である、（２）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（５）Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、ｍが０又は２であり、ｎ2が６以上の整数である、（２）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（６）Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、ｍが０又は２であり、ｎ2が６又は８である、（２）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（７）Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、ｍが０又は２であり、ｎ2が８である、（２）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（８）Ｒ１及びＲ３が水素原子であり、Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、ｍが２であり、ｎ2が８である、（１）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（９）標的遺伝子に対するセンス鎖ポリヌクレオチド、及び該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有するポリヌクレオチドであって、該アンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端と該センス鎖ポリヌクレオチドの３’末端がリン酸ジエステル結合を介してリンカーによって結合された次式で示される構造のポリヌクレオチド又はその塩
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
式中、
ｐは、０から４の整数を示し、
ｑは、４から１０の整数を示し、
Ｌ５は、単結合又は－Ｏ－を示し、
Ｌ６は、（ＣＨ２）ｐとの結合を基点として、－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＨ－、又は－ＮＨ－（Ｃ＝Ｏ）－を示し、
Ｌ５のベンゼン環上の結合位置はパラ位又はメタ位であり、
Ｌ５が－Ｏ－であるときは、ｐは１から４の整数を示す、
（１０）ｐとｑの和が３以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（９）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（１１）ｐとｑの和が８以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（９）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（１２）ｐが０又は２であり、ｑが６以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（９）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（１３）ｐが０又は２であり、ｑが６又は８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（９）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（１４）ｐが０又は２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（９）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（１５）ｐが２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（９）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（１６）センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、更に以下の（ａ）乃至（ｄ）に示される特徴を有する、（１）乃至（１５）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩：
５’－（γ－β）９－γ－λｔ－３’（ＩＩ）
５’－β－（γ－β）９－υｕ－３’（ＩＩＩ）
（ａ）γはＲＮＡ、βは２’－ＯＭｅＲＮＡ、λ及びυはＤＮＡを示す；
（ｂ）ｔ及びｕは同一又は異なって、０～５のいずれかの整数を示す。；
（ｃ）式（ＩＩ）で示されるポリヌクレオチドのうち、（γ－β）９－γは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる；
（ｄ）式（ＩＩ）における（γ－β）９－γと式（ＩＩＩ）におけるβ―（γ－β）９は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる、
（１７）センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＶ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（Ｖ）に示すポリヌクレオチドからなり、更に以下の（ａ）乃至（ｄ）に示される特徴を有する、（１）乃至（１５）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩：
５’－（α－β）９－αｐ－λｔ－３’（ＩＶ）
５’－δｓ－（α－β）９－υｕ－３’（Ｖ）
（ａ）α及びβは異なってＤＮＡ又は２’－ＯＭｅＲＮＡ、δ及びλは同一又は異なってＤＮＡ又は２’－ＯＭｅＲＮＡ、υは同一又は異なってはＤＮＡ、ＲＮＡ及び２’－ＯＭｅＲＮＡから選択されるいずれかのヌクレオチドを示す；
（ｂ）ｐは０又は１の整数を示し、ｔはｐが０のときは０であり、ｐが１のときは０～５のいずれかの整数を示す。ｓは０又は１の整数を示し、ｕは０～５のいずれかの整数を示す。；
（ｃ）式（ＩＶ）で示されるポリヌクレオチドのうち、（α－β）９－αｐは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる；
（ｄ）式（ＩＶ）における（α－β）９と式（Ｖ）における（α－β）９は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる、
（１８）センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＶＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＶＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、更に、以下の（ａ）乃至（ｄ）に示される特徴を有する、（１）乃至（１５）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩：
５’－β－（α－β）８－αｐ－λｔ－３’（ＶＩ）
５’－δｓ－（α－β）８－（α―β）－υｕ－３’（ＶＩＩ）
（ａ）α及びβは異なってＤＮＡ又は２’－ＯＭｅＲＮＡ、δ及びλは同一又は異なってＤＮＡ又は２’－ＯＭｅＲＮＡ、υは同一又は異なってはＤＮＡ、ＲＮＡ及び２’－ＯＭｅＲＮＡから選択されるいずれかのヌクレオチドを示す；
（ｂ）ｐは０又は１の整数を示し、ｔはｐが０のときは０であり、ｐが１のときは０～５のいずれかの整数を示す。ｓは０又は１の整数を示し、ｕは０～５のいずれかの整数を示す；
（ｃ）式（ＶＩ）で示されるポリヌクレオチドのうち、β－（α－β）８－αｐは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる；
（ｄ）式（ＶＩ）における（α－β）８と式（ＶＩＩ）における（α－β）８は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる、
（１９）αがＤＮＡ、βが２’－ＯＭｅＲＮＡであることを特徴とする、（１７）又は（１８）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（２０）λｔ及びυｕが同一又は異なってチミン塩基、アデニン塩基又はグアニン塩基を有するＤＮＡ、又は、ウラシル塩基、アデニン塩基又はグアニン塩基を有する２’－ＯＭｅＲＮＡのいずれかであることを特徴とする、（１６）乃至（１９）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（２１）ｔが０、ｕが２であることを特徴とする、（１６）乃至（２０）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（２２）ｐ及びｔが０、ｓが１、ｕが２であることを特徴とする、（１７）乃至（２０）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（２３）ｐ及びｔが０、ｓが０又は１、ｕが２であり、υ２がＤＮＡ又は２’－ＯＭｅＲＮＡであることを特徴とする、（１７）乃至（２０）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（２４）センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＶＩＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＸ）に示すポリヌクレオチドからなり、更に、以下の（ａ）乃至（ｃ）に示される特徴を有する、（１）乃至（１５）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩：
５’－（α－β）９－３’（ＶＩＩＩ）
５’－β－（α－β）９－（α－β）－３’（ＩＸ）
（ａ）αがＤＮＡ、βが２’－ＯＭｅＲＮＡである；
（ｂ）式（ＩＸ）で示されるポリヌクレオチドのうち、β－（α－β）９は標的遺伝子と相補的なヌクレオチド配列からなる；
（ｃ）式（ＶＩＩＩ）における（α－β）９と式（ＩＸ）における（α－β）９は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる、
（２５）２’－ＯＭｅＲＮＡの任意の１～４残基がＥＮＡ又は２’，４’－ＢＮＡ／ＬＮＡに置換されていることを特徴とする、（１６）乃至（２４）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（２６）ＤＮＡの任意の１～４残基がＲＮＡ、ＥＮＡ又は２’，４’－ＢＮＡ／ＬＮＡに置換されていることを特徴とする、（１６）乃至（２５）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（２７）各ヌクレオチドがリン酸ジエステル結合又はホスホロチオエート結合で結合していることを特徴とする、（１）乃至（２６）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（２８）（１）乃至（２７）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩を有効成分として含有する医薬、
（２９）遺伝子発現に由来する疾患を治療するための、（２９）に記載の医薬、
（３０）（１）乃至（２９）から選択されるポリヌクレオチド又はその塩を哺乳動物に投与することによる、標的遺伝子の発現抑制方法、
（３１）（１）乃至（２７）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩を含有する試薬。
（３２）式（Ｘ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
[式中、Ｔｒは、水酸基の保護基を示し、ｐは、０から４の整数を示し、ｑは、４から１０の整数を示し、Ｌ５は、単結合又は－Ｏ－を示し、Ｌ６は、（ＣＨ２）ｐとの結合を基点として、－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＨ－、又は－ＮＨ－（Ｃ＝Ｏ）－を示し、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置はパラ位又はメタ位である。]を有する化合物又はその塩、
（３３）Ｔｒが４－メトキシトリチル基、４，４’－ジメトキシトリチル基、ピクシル基、トリチル基、レブリニル基、又はビス（トリメチルシリルオキシ）（シクロヘキシルオキシ）シリル基である、（３２）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（３４）Ｔｒが４－メトキシトリチル基又は４，４’－ジメトキシトリチル基であり、ｐとｑの和が３以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（３２）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（３５）Ｔｒが４－メトキシトリチル基又は４，４’－ジメトキシトリチル基であり、ｐとｑの和が８以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（３２）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（３６）Ｔｒが４－メトキシトリチル基又は４，４’－ジメトキシトリチル基であり、ｐが０又は２であり、ｑが６以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（３２）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（３７）Ｔｒが４－メトキシトリチル基又は４，４’－ジメトキシトリチル基であり、ｐが０又は２であり、ｑが６又は８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（３２）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（３８）Ｔｒが４－メトキシトリチル基又は４，４’－ジメトキシトリチル基であり、ｐが０又は２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（３２）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（３９）Ｔｒが４－メトキシトリチル基又は４，４’－ジメトキシトリチル基であり、ｐが２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（３２）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（４０）Ｔｒが４，４’－ジメトキシトリチル基であり、ｐが２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（３２）に記載の化合物又はその塩、
（４１）標的遺伝子に対するセンス鎖ポリヌクレオチド、及び該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有するポリヌクレオチドであって、該アンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端と該センス鎖ポリヌクレオチドの３’末端がリン酸ジエステル結合を介してＸによって結合された、式（ＸＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
を有する化合物[式中、Ｗ２’は、５’末端、及び３’末端の水酸基を除いたセンス鎖ポリヌクレオチドを示し、Ｗ１’－Ｙ’は、５’末端、及び３’末端の水酸基を除いたアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを示し、Ｘは、式（ＸＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
[式中、ｐは、０から４の整数を示し、ｑは、４から１０の整数を示し、Ｌ５は、単結合又は－Ｏ－を示し、Ｌ６は、（ＣＨ２）ｐとの結合を基点として、－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＨ－、又は－ＮＨ－（Ｃ＝Ｏ）－を示し、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置はパラ位又はメタ位であり、Ｌ５が－Ｏ－であるときは、ｐは１から４の整数を示す。] を示し、末端のメチレン基は該センス鎖ポリヌクレオチドの３’末端に結合してリン酸ジエステル結合を形成し、フェニル基に結合している酸素原子は該アンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端に結合してリン酸ジエステル結合を形成する。]を製造する方法であって、
（i）式Ｔｒ－Ｏ－Ｘ－Ｈ[式中、Ｔｒは、水酸基の保護基を示し、Ｘの－（ＣＨ２）ｑ－はＴｒ－Ｏ－に結合し、フェニル基に結合している酸素原子は水素に結合する。]を有する化合物の水酸基を、式（ＸＩＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
又は、式（ＸＩＶ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
[式中、Ｒ４は、２－シアノエチル基、メチル基、メタンスルホニルエチル基、２，２，２－トリクロロエチル基、又は４－クロロフェニルメチル基を示し、Ｒ５は、モルホリノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、又はジメチルアミノ基を示す。] を有する化合物と反応させて、式（ＸＶ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
を有する化合物を製造する工程；
（ii）上記（i）で得られた化合物をホスホロアミダイト法により、式ＨＯ－Ｗ１－Ｙ－ＣＰＧ[式中、Ｗ１－Ｙは、５’末端、及び３’末端の水酸基を除いた保護されたアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを示し、ＣＰＧは、ポリヌクレオチドと結合しうるリンカーを有するポリマーサポートを示す。]を有する化合物と反応させて、続いて、ホスホロアミダイト法により、式Ｔｒ１－Ｏ－Ｗ２－Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ４）－Ｏ－[式中、Ｔｒ１は、水酸基の保護基を示し、Ｗ２は、５’末端、及び３’末端の水酸基を除いた保護されたセンス鎖ポリヌクレオチドを示す。]部分を製造し、式（ＸＶＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
を有する化合物を製造する工程；及び、
（iii）上記（ii）で得られた化合物をＣＰＧより切り出し、保護基の除去を行う工程からなる、式（ＸＩ）を有する化合物を製造する方法、
（４２）Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４－メトキシトリチル基、４，４’－ジメトキシトリチル基、ピクシル基、トリチル基、レブリニル基、又はビス（トリメチルシリルオキシ）（シクロヘキシルオキシ）シリル基である、（４１）に記載の方法、
（４３）Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４－メトキシトリチル基又は４，４’－ジメトキシトリチル基であり、ｐとｑの和が３以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（４１）に記載の方法、
（４４）Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４－メトキシトリチル基又は４，４’－ジメトキシトリチル基であり、ｐとｑの和が８以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（４１）に記載の方法、
（４５）Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４－メトキシトリチル基又は４，４’－ジメトキシトリチル基であり、ｐが０又は２であり、ｑが６以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（４１）に記載の方法、
（４６）Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４－メトキシトリチル基又は４，４’－ジメトキシトリチル基であり、ｐが０又は２であり、ｑが６又は８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（４１）に記載の方法、
（４７）Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４－メトキシトリチル基又は４，４’－ジメトキシトリチル基であり、ｐが０又は２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（４１）に記載の方法、
（４８）Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４－メトキシトリチル基又は４，４’－ジメトキシトリチル基であり、ｐが２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（４１）に記載の方法、
（４９）Ｔｒ及びＴｒ１が、４，４’－ジメトキシトリチル基であり、ｐが２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（４１）に記載の方法、
（５０）Ｒ４が２－シアノエチル基、メチル基、メタンスルホニルエチル基、２，２，２－トリクロロエチル基、又は４－クロロフェニルメチル基であり、Ｒ５がモルホリノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、又はジメチルアミノ基である、（４１）乃至（４９）のいずれか１項に記載の方法、
（５１）Ｒ４が２－シアノエチル基又はメチル基であり、Ｒ５がモルホリノ基又はジイソプロピルアミノ基である、（４１）乃至（４９）のいずれか１項に記載の方法、
（５２）式（ＸＩＩＩ）を有する化合物が、クロロ（モルホリノ）メトキシホスフィン、クロロ（モルホリノ）シアノエトキシホスフィン、クロロ（ジイソプロピルアミノ）メトキシホスフィン又はクロロ（ジイソプロピルアミノ）シアノエトキシホスフィンである、（４１）乃至（４９）のいずれか１項に記載の方法、
（５３）式（ＸＩＶ）を有する化合物が、ビス（ジイソプロピルアミノ）シアノエトキシホスフィンである、（４１）乃至（４９）のいずれか１項に記載の方法、
（５４）下記から選択されるポリヌクレオチド又はその塩
ＨＯ－Ｃｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ａｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＨＳ－００５）、
ＨＯ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｕｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ａｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＨＳ－００６）、
ＨＯ－Ｃｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ａｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｓ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＨＳ－００５ｓ）、又は、
ＨＯ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｕｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ａｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｓ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＨＳ－００６ｓ）
[式中、Ａｐ、Ｇｐ、Ｃｐ、Ｔｐ、Ｔｓ、Ａｍ１ｐ、Ｇｍ１ｐ、Ｃｍ１ｐ、Ｕｍ１ｐ、Ｕｍ１ｔは次式で示される構造のヌクレオシド、又は、ヌクレオチドを示し、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
Ｘの前方は、標的遺伝子に対するセンス鎖ポリヌクレオチドを示し、Ｘの後方は、該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを示し、Ｘは式（ＸＶＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
で示される構造のリンカーを示し、末端のメチレン基は該センス鎖ポリヌクレオチドの３’末端に結合してリン酸ジエステル結合を形成し、フェニル基に結合している酸素原子は該アンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端に結合してリン酸ジエステル結合を形成する。]、
（５５）（５４）に記載のポリヌクレオチド又はその塩を有効成分として含有する医薬、
（５６）Ｈｓｐ４７遺伝子の発現に由来する疾患を治療するための、（５５）に記載の医薬、
（５７）Ｈｓｐ４７遺伝子の発現に由来する疾患が線維症である、（５６）に記載の医薬、
（５８）（５４）に記載のポリヌクレオチド又はその塩を哺乳動物に投与することによる、Ｈｓｐ４７遺伝子の発現抑制方法、
（５９）（５４）に記載のポリヌクレオチド又はその塩を含有する試薬、
からなる。
　本発明により、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有するポリヌクレオチドが提供された。また、本発明により、ＲＮＡ分解酵素、ホスファターゼ、及びエキソヌクレアーゼから選択される少なくともいずれか一つに対して安定なＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有するポリヌクレオチドが提供された。また本発明により、ＲＮＡ分解酵素、ホスファターゼ、及びエキソヌクレアーゼに対して安定なＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有するポリヌクレオチドが提供された。また、本発明により、センス鎖ポリヌクレオチドとアンチセンス鎖ポリヌクレオチドをそれぞれ製造する工程が不要であり、かつ両鎖が同量になるように正確に混合し２本鎖を形成させる煩雑な操作が不要であって、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有するポリヌクレオチドが提供された。該ポリヌクレオチドを用いて各種遺伝子の機能解析が可能になり、また、該ポリヌクレオチドを含む医薬品が提供される。
　また本発明により、該ポリヌクレオチドを得るために有用な合成中間体が提供された。また本発明により、該ポリヌクレオチドの製造方法が提供された。
Ａ－１工程の概要を示す図。 Ｃ法及びＤ法の概要を示す図。 Ｅ法及びＦ法の概要を示す図。 Ｇ法の概要を示す図。 参考例３～参考例１４、参考例１７、参考例２１～参考例２３に記載の化合物の構造を示す図。 ヒトβ－カテニン遺伝子に対するポリヌクレオチドを示す図。以下、各図中、センス鎖、アンチセンス鎖の実施例のポリヌクレオチドの組み合わせを示す。シンボルのうち、黒丸（●）はＤＮＡ、白丸（○）は２’－Ｏ－メチルＲＮＡを示す。黒丸-白丸間の線は、ヌクレオシド間のリン酸ジエステル結合を示す。図中のｐは－Ｐ(＝Ｏ)(ＯＨ)－を示し、ｐが結合している場合、ポリヌクレオチドの末端の水酸基の水素原子は除かれる。ポリヌクレオチドの末端に何も結合してない場合、ＤＮＡ、或いは、２’－Ｏ－メチルＲＮＡの３’末端或いは５’末端はＯＨ基である。ｎは炭素数を示す。図７および図１１でも同じである。また、各ポリヌクレオチドの塩基配列も示す。 ヒトβ－カテニン遺伝子に対するポリヌクレオチドを示す図。 リアルタイムＰＣＲ解析によるポリヌクレオチドの遺伝子抑制活性を示す図。 リアルタイムＰＣＲ解析によるポリヌクレオチドの遺伝子抑制活性を示す図。 参考例２４～参考例３１に記載の化合物の構造を示す図。 ヒトβ－カテニン遺伝子に対するポリヌクレオチドを示す図。 リアルタイムＰＣＲ解析によるポリヌクレオチドの遺伝子抑制活性を示す図。 ヒトβ－カテニン遺伝子に対するポリヌクレオチドを示す図。シンボルのうち、白四角（□）はＲＮＡ、黒丸（●）はＤＮＡ、白丸（○）は２’－Ｏ－メチルＲＮＡを示す。各ヌクレオシド間を結ぶ線は、リン酸ジエステル結合を示す。図中のｐは－Ｐ(＝Ｏ)(ＯＨ)－を示し、ｐが結合している場合、ポリヌクレオチドの末端の水酸基の水素原子は除かれる。ポリヌクレオチドの末端に何も結合してない場合、ＲＮＡ、ＤＮＡ、或いは、２’－Ｏ－メチルＲＮＡの３’末端或いは５’末端はＯＨ基である。ｎは炭素数を示す。図１５、図１６および図１９でも同じである。また、各ポリヌクレオチドの塩基配列も示す。 リアルタイムＰＣＲ解析によるポリヌクレオチドの遺伝子抑制活性を示す図。 マウスPKR遺伝子に対するポリヌクレオチドを示す図。 ラット、ヒトＨｓｐ４７遺伝子に対するポリヌクレオチドを示す図。図中のｓはホスホロチオエート結合を示す。 リアルタイムＰＣＲ解析によるポリヌクレオチドを遺伝子抑制活性を示す図。ポリヌクレオチドの濃度として、白色のバーは０．１ｎＭの場合を示し、黒色のバーは、１ｎＭの場合を示す。図１８および図２０でも同じである。 リアルタイムＰＣＲ解析によるポリヌクレオチドを遺伝子抑制活性を示す図。 ラット、ヒトＨｓｐ４７遺伝子に対するポリヌクレオチドを示す図。 リアルタイムＰＣＲ解析によるポリヌクレオチドを遺伝子抑制活性を示す図。
　１．用語の説明
　本明細書において、「標的遺伝子」とは、これを導入する細胞、組織、あるいは固体（以下これを「被導入体」と称することがある。）においてＲＮＡであれば特に制限されず、タンパク質に翻訳されるｍＲＮＡであってもタンパク質に翻訳されないノンコーディングＲＮＡであってもよい。ノンコーディングＲＮＡとしては、機能性ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡの非翻訳領域、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ型ｎｃＲＮＡ（ｍＲＮＡ－ｌｉｋｅｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ　ＲＮＡ）、長鎖ｎｃＲＮＡ（ｌｏｎｇ　ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ　ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｎｕｃｌｅａｒ　ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｎｕｃｌｅｏｌａｒ　ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）等が挙げられる。具体的には、導入する被導入体に内在性のものでも、遺伝子導入等の手法によって導入される外来性のものでもよい。また、染色体上に存在する遺伝子でも、染色体外のものでもよい。外来性の遺伝子としては、例えば、被導入体に感染可能なウイルス、バクテリア、真菌又は原生動物由来のものが挙げられるがこれらに制限されない。遺伝子の機能については既知のものでも未知のものでもよい。
　そのような標的遺伝子の例としては、特定の疾患を有する患者において特異的に発現が上昇している及び／又は特異的に変異している遺伝子を挙げることができ、疾患としては、中枢疾患（例えば、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、炎症性疾患（例えば、アレルギー、リュウマチ、変形性関節症、エリテマトーデスなど）、循環器疾患（例えば、高血圧症、心肥大、狭心症、動脈硬化症、高コレステロール血症等）、癌（例えば、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膵臓癌、肝癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌等）、呼吸器疾患（例えば、肺炎、気管支炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患など）、糖尿病、糖尿病網膜症、糖尿病性腎症、貧血（例えば、慢性疾患に伴う貧血、鉄不応性鉄欠乏性貧血等）、加齢性黄斑変性症、免疫系疾患（例えば、クローン病、アトピー性皮膚炎、自己免疫疾患、免疫不全、白血病等）、肝臓・胆のう疾患（例えば、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変、肝炎、肝不全、胆汁うっ滞症、結石等）、消化管疾患（例えば、潰瘍、腸炎、吸収不良等）、感染症、肥満、線維症（肺線維症、肝線維症、腎線維症、骨髄線維症等）を挙げることができ、これらの疾患の原因遺伝子としては、例えば、ｋｉｎｅｓｉｎ　ｓｐｉｎｄｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＫＳＰ）、ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ，　（ＶＥＧＦ）、ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ　（ＴＴＲ）、ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ　ｓｕｂｔｉｌｉｓｎ／ｋｅｘｉｎ　ｔｙｐｅ　９（ＰＣＳＫ９）、ｐｏｌｏ－ｌｉｋｅ　ｋｉｎａｓｅ（ＰＬＫ）、ＡｐｏＢ－１００、ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　Ｍ２　ｓｕｂｕｎｉｔ　（ＲＲＭ２）、ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２７（Ｈｓｐ２７）、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ－４Ｅ　（ｅＩＦ－４Ｅ）、ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　１（ＩＣＡＭ－１）、ａｌｐｈａ　ｓｕｂｕｎｉｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　４　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　（ＩＬ－４Ｒ－ａｌｐｈａ）、Ｆａｃｔｏｒ　ＸＩ、　Ｆａｃｔｏｒ　ＶＩＩ、Ｎ－ｒａｓ、Ｈ－ｒａｓ、Ｋ－ｒａｓ、ｂｃｌ－２、ｂｃｌ－ｘＬ、Ｈｅｒ－１、Ｈｅｒ－２、Ｈｅｒ－３、Ｈｅｒ－４、ＭＤＲ－１、ヒトβ－カテニン遺伝子、ＤＤＸ３（ＤＥＡＤ　（Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ａｓｐ）　ｂｏｘ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　３，　Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ）、Ｍｙｅｌｏｉｄ　Ｃｅｌｌ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　１（ＭＣＬ１）遺伝子、ＰＫＲ（Ｅｉｆ２ａｋ２）、Ｈｓｐ４７（Ｓｅｒｐｉｎｈ１）、Ｈｅｐｃｉｄｉｎ、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｄｕｃｅｒ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ(ＳＴＡＴ３)を挙げることが出来るがこれらに限定されない。
　本明細書において、「天然型のヌクレオシド」とは、２’－デオキシアデノシン、２’－デオキシグアノシン、２’－デオキシシチジン、２’－デオキシ－５－メチルシチジン、チミジン等の２’－デオキシヌクレオシド、アデノシン、グアノシン、シチジン、５－メチルシチジン、ウリジン等のリボヌクレオシドをいう。また、「オリゴヌクレオチド」とは、ヌクレオシドの糖部分がリン酸とエステルを形成している化合物から構成されるオリゴヌクレオチドのことをいう。本明細書においては、オリゴヌクレオチドとポリヌクレオチドとは同一の意味で用いている。
　本明細書においては２’－デオキシアデノシンをＡｔ、２’－デオキシグアノシンをＧｔ、２’－デオキシシチジンをＣｔ、２’－デオキシ－５－メチルシチジンを５ｍｅＣｔ、チミジンをＴｔ、２’－デオキシウリジンをＵｔ、アデノシンをＡｒｔ、グアノシンをＧｒｔ、シチジンをＣｒｔ、５－メチルシチジンを５ｍｅＣｒｔ、ウリジンをＵｒｔと表すこともある。また、本明細書中においては、２’－デオキシアデノシンヌクレオチドをＡｐ、２’－デオキシグアノシンヌクレオチドをＧｐ、２’－デオキシシチジンヌクレオチドをＣｐ、２’－デオキシ－５－メチルシチジンヌクレオチドを５ｍｅＣｐ、チミジンヌクレオチドをＴｐ、２’－デオキシウリジンヌクレオチドをＵｐ、アデノシンヌクレオチドをＡｒｐ、グアノシンヌクレオチドをＧｒｐ、シチジンヌクレオチドをＣｒｐ、５－メチルシチジンヌクレオチドを５ｍｅＣｒｐ、ウラシルヌクレオチドをＵｒｐと表すこともある。
　本明細書においてはヌクレオチドのリン酸エステルの代わりにホスホロチオエートエステルとなっているホスホロチオエートエステルについて、Ａｐに対応するものとしてＡｓ、Ｇｐに対応するものとしてＧｓ、Ｃｐに対応するものとしてＣｓ、５ｍｅＣｐに対応するものとして５ｍｅＣｓ、Ｔｐに対応するものとしてＴｓ、Ｕｐに対応するものとしてＵｓ、Ａｒｐに対応するものとしてＡｒｓ、Ｇｒｐに対応するものとしてＧｒｓ、Ｃｒｐに対応するものとしてＣｒｓ、５ｍｅＣｒｐに対応するものとして５ｍｅＣｒｓ、Ｕｒｐに対応するものとしてＵｒｓと表すこともある。
　本明細書における、「糖修飾ヌクレオシド」とは、ヌクレオシドの糖部分が修飾されているヌクレオシドをいう。
　このうち、２’－Ｏ－メチル修飾の例としては、２’－Ｏ－メチルヌクレオシド及び２’－Ｏ－メチルヌクレオチドがあり、Ａｒｔに対応するものとしてＡｍ１ｔ、Ｇｒｔに対応するものとしてＧｍ１ｔ、Ｃｒｔに対応するものとしてＣｍ１ｔ、５ｍｅＣｒｔに対応するものとして５ｍｅＣｍ１ｔ、Ｕｒｔに対応するものとしてＵｍ１ｔ、Ａｒｐに対応するものとしてＡｍ１ｐ、Ｇｒｐに対応するものとしてＧｍ１ｐ、Ｃｒｐに対応するものとしてＣｍ１ｐ、５ｍｅＣｒｐに対応するものとして５ｍｅＣｍ１ｐ、Ｕｒｐに対応するものとしてＵｍ１ｐ、Ａｒｓに対応するものとしてＡｍ１ｓ、Ｇｒｓに対応するものとしてＧｍ１ｓ、Ｃｒｓに対応するものとしてＣｍ１ｓ、５ｍｅＣｓに対応するものとして５ｍｅＣｍ１ｓ、Ｕｒｓに対応するものとしてＵｍ１ｓと表すこともある。
　本明細書において２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレンヌクレオチド　ユニット及び「ＥＮＡユニット」とは上記の各ヌクレオシド、各ヌクレオチドにおいてＥＮＡを有するものをいい、Ａｔに対応するものとしてＡ２ｔ、Ａｐに対応するものとしてＡｅ２ｐ、Ａｓに対してはＡｅ２ｓ、Ｇｔに対応するものとしてＧ２ｔ、Ｇｐに対応するものとしてＧｅ２ｐ、Ｇｓに対してはＧｅ２ｓ、５ｍｅＣｔに対応するものとしてＣ２ｔ、５ｍｅＣｐに対応するものとしてＣｅ２ｐ、５ｍｅＣｓに対してはＣｅ２ｓ、Ｔｔに対応するものとしてＴ２ｔ、Ｔｐに対応するものとしてＴｅ２ｐ、Ｔｓに対してはＴｅ２ｓというようにＥＮＡユニットを有するヌクレオシド及びヌクレオチドを表わすこともある。
　本明細書において２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレンヌクレオチド　ユニット及び「２’、４’－ＢＮＡ／ＬＮＡユニット」とは上記の各ヌクレオシド、各ヌクレオチドにおいて２’、４’－ＢＮＡ／ＬＮＡを有するものをいい、Ａｔに対応するものとしてＡ１ｔ、Ａｐに対応するものとしてＡｅ１ｐ、Ａｓに対してはＡｅ１ｓ、Ｇｔに対応するものとしてＧ１ｔ、Ｇｐに対応するものとしてＧｅ１ｐ、Ｇｓに対してはＧｅ１ｓ、５ｍｅＣｔに対応するものとしてＣ１ｔ、５ｍｅＣｐに対応するものとしてＣｅ１ｐ、５ｍｅＣｓに対してはＣｅ１ｓ、Ｔｔに対応するものとしてＴ１ｔ、Ｔｐに対応するものとしてＴｅ１ｐ、Ｔｓに対してはＴｅ１ｓというように２’、４’－ＢＮＡ／ＬＮＡユニットを有するヌクレオシド及びヌクレオチドを表わすこともある。
　以下に各ヌクレオチドの構造式を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　本明細書中におけるポリヌクレオチド又はその塩は、標的遺伝子に対するセンス鎖ポリヌクレオチド、及び該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有する２本鎖ポリヌクレオチドを由来とし、このアンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端が、各々においてリン酸ジエステル構造を形成した下記の構造式で示される構造のリンカーによって結合されている１本鎖構造を有することが特徴である。すなわち、ポリヌクレオチド－３’－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－［リンカー］－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－５’－ポリヌクレオチドの構造を形成している。［ここで，『ポリヌクレオチド－３’』は、ポリヌクレオチドの３’末端の水酸基上の水素原子を持たない構造を表し、『５’－ポリヌクレオチド』は、ポリヌクレオチドの５’末端の水酸基上の水素原子を持たない構造を示す。］
　このリンカーは、フェニル基を含有しており、このフェニル基に結合する酸素原子部分、次の化１８の構造式において明示されている酸素原子を示す、がアンチセンス鎖の５’末端との結合部分であり、５’末端においてリン酸ジエステル結合を形成して結合している。このフェニル基は、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３をさらに有しており、そのうちの１個がセンス鎖の３’末端との結合部位となっていてリン酸ジエステル結合を形成して結合する。なお，Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のフェニル基への結合が酸素原子を介していてもこれらの酸素原子はアンチセンス鎖の５’末端への結合部位とはならない。このリンカーの構造は次の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
式中、
明示されているフェニル基に結合した酸素原子は、アンチセンス鎖の５’末端に結合してリン酸ジエステル構造を形成し、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のいずれか１個は、次式で示される構造：
－Ｌ１－（ＣＨ２）ｍ－Ｌ２－Ｌ３－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）n1－（ＣＨ２）n2－Ｏ→
を示すが、式中、
ｍは、０から４の整数を示し、
ｎ1は、０から４の整数を示し、
ｎ2は、０又は２から１０の整数を示し、
Ｌ１は、単結合又は－Ｏ－を示し、
Ｌ２は、単結合又は－ＣＨ（－ＮＨ－Ｌ４－Ｒ）－を示し、
Ｌ３は、単結合、－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＨ－、又は－ＮＨ－（Ｃ＝Ｏ）－を示すが、
Ｌ３が単結合以外のとき、ｎ2は、２から１０の整数を示す。
Ｌ１及びＬ２が単結合であって、ｍが１、ｎ1およびｎ2が０であるときに、Ｌ３－Ｏ→は、
－ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ－（アミノ酸残基）ｊ－Ｓｅｒ、
－ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ－（アミノ酸残基）ｊ－Ｔｈｒ、
－ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ－（アミノ酸残基）ｊ－Ｓｅｒ、又は
－ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ－（アミノ酸残基）ｊ－Ｔｈｒ、
を示すが、これらのセリン又はトレオニンの水酸基部分は、センス鎖ポリヌクレオチドの３’末端のリン酸基と結合してリン酸ジエステル構造を形成しており、
ｊは、０から２の整数を示し、
Ｌ４は、単結合、－（Ｃ＝Ｏ）－（ＣＨ２）ｋ－ＮＨ－、又は－（Ｃ＝Ｏ）－（ＣＨ２）ｋ－を示し、
ｋは１から６の整数を示し、
Ｒは、水素原子、炭素数１から６のアルキル基、飽和又は不飽和であってもよい炭素数２から３０の炭化水素カルボニル基、飽和又は不飽和であってもよい炭素数２から３０の炭化水素オキシカルボニル基を示す。

Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のうちの残りの２個は、各々独立に、
水素原子、
置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルキル基、
置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルコキシ基、
ハロゲン原子、
炭素数１から９のアルキル基を有するアルキルカルボニルアミノ基、及び
置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルキル基を含むアルキルカルボニル基、
からなる群の基から選ばれる基を示す。
　リンカーに含まれるフェニル基にはＲ１、Ｒ２及びＲ３が存在するが、そのうちの１個はリンカー機能を有した、センス鎖の３’末端との結合部位となっており、構造的にはリン酸ジエステル構造を形成することを特徴としている。残りの２個はリンカー機能はなく、フェニル基上の単なる置換基である。
　リンカー機能を果たす構造のうちのフェニル基部分を除いた部分、すなわち、－Ｌ１－（ＣＨ２）ｍ－Ｌ２－Ｌ３－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）n1－（ＣＨ２）n2－Ｏ→、について説明する。
　Ｌ１は、単結合であるか、又は２価の酸素原子の－Ｏ－である。
　Ｌ２は、単結合であるか、又はメチレン炭素原子上に置換基を有していてもよいアミノ基を有する構造である。このアミノ基は、リンカー構造Ｌ４を介して置換基Ｒを有する。
　Ｌ４は、単結合であるか、メチレン基もしくは炭素数２から４のポリメチレン基であるか、又は－（Ｃ＝Ｏ）－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－構造である。－（Ｃ＝Ｏ）－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－構造のカルボニル基は、アミノ基とは構造式の左端で結合し、－ＮＨ－（Ｃ＝Ｏ）－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－の構造を形成する。
　Ｒが、炭素数１から６のアルキル基であるとき、このアルキル基は直鎖状でも分枝鎖状であってもいずれでもよい。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、第二級ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等を挙げることができる。
　Ｒが、炭素数１から６のアルキル基であるとき、これは直鎖状又は分枝鎖状のいずれであってもよい。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、第二級ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等を挙げることができる。
　Ｒが、飽和又は不飽和であってもよい炭素数２から３０の炭化水素カルボニル基（炭化水素基－（Ｃ＝Ｏ）－）であるとき、あるいは飽和又は不飽和であってもよい炭素数２から３０の炭化水素オキシカルボニル基（炭化水素基－Ｏ－（Ｃ＝Ｏ）－）であるとき、これらの炭化水素基部分は直鎖状又は分枝鎖状であってもよい。また、炭化水素基は飽和であってよいが、不飽和となっていてもよい。このような炭化水素基としては脂肪族炭化水素から導かれた基を挙げることができる。炭化水素基としては炭素数３０までのアルキル基を挙げることができる。この他にこのアルキル基内の炭素炭素結合が二重結合となって不飽和となったアルカン類であってもよい。さらに、この炭化水素基部分は、不飽和結合を含んで、縮合環状構造となっていてもよい。このような環状炭化水素基としてコレステリル基を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
　Ｌ３は、単結合であるか、－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＨ－又は－ＮＨ－（Ｃ＝Ｏ）－の構造となる。Ｌ３は左端がＬ２と結合しており、場合によっては化８に示されているフェニル基と直結することもある。なおＬ３が単結合ではないとき、すなわちＬ３が－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＨ－又は－ＮＨ－（Ｃ＝Ｏ）－であるとき、これらに結合する下記の構造において、メチレン基又はポリメチレン基が必ず存在する。すなわち、この場合においてｎ2は０とはならない。
　Ｌ３の右端には－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）n1－（ＣＨ２）n2－Ｏ→が結合する構造である。ジメチレンオキシ構造は１個（ｎ1＝１）、あるいはこれを１単位として反復された２から４個（ｎ1＝２～４）が結合してもよい。なお、場合によってはこのジメチレンオキシ構造は存在しないこともある。ジメチレンオキシ構造は、２または３個の反復のものが好ましい。すなわち、ｎ1としては２または３が好ましい。より好ましくはジメチレンオキシ構造が２個の場合であり、ｎ1としては２がより好ましい。
このジメチレンオキシ構造の右端にはメチレン基または９までのポリメチレン基が結合するが、このメチレン基またはポリメチレン基は存在しないこともある。メチレン基またはポリメチレン基としては、ポリメチレン基が好ましい。ポリメチレン基として存在する場合、鎖長は炭素数で２から１０となるものが好ましい。ポリメチレン鎖は鎖長の長いものの方が好ましく、炭素数５以上のポリメチレン鎖が好ましい。さらに好ましくは炭素数７以上のポリメチレン鎖である。
ジメチレンオキシ構造とメチレン基もしくはポリメチレン基は混在していてもよく、この場合、鎖長として原子数２から１０程度のものであればよい。
　Ｌ１及びＬ２が単結合であって、ｍが１でｎ1およびｎ2が０であるとき、－Ｌ１－（ＣＨ２）ｍ－Ｌ２－Ｌ３－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）n1－（ＣＨ２）n2－Ｏ→部分は、Ｌ３－Ｏ→となるが、このＬ３－Ｏ→は、－ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ－（アミノ酸残基）ｊ－Ｓｅｒ、－ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ－（アミノ酸残基）ｊ－Ｔｈｒ、－ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ－（アミノ酸残基）ｊ－Ｓｅｒ、又は－ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ－（アミノ酸残基）ｊ－Ｔｈｒの各々の構造を示す。
　この各構造は、ポリペプチドとなっているが、そのポリペプチドの一端はチロシンであり、他端は水酸基含有アミノ酸であればよい。さらに，チロシンのフェニル基は、５’末端とのリン酸ジエステル構造の結合部位であり、他端のアミノ酸の水酸基部分は、３’末端とのリン酸ジエステル構造の結合部位となっている。３’末端と結合しているアミノ酸は水酸基を含有するアミノ酸であればいずれでもよく、セリン又はトレオニンであればよい。なお、このセリンおよびトレオニンのアミノ基はアシル基によって置換されていてもよい。このアシル基は、フェニルカルボニル基またはアルキルカルボニル基でよい。フェニルカルボニル基のフェニル基は、炭素数１から６のアルキル基、炭素数１から６のアルキコキシ基、ハロゲン原子等で置換されていてもよい。アルキルカルボニル基のアルキル基は、炭素数１から６のアルキル基であればよく、直鎖状でも分枝鎖状であってもよく、炭素数１から６のアルキコキシ基、ハロゲン原子等でさらに置換されていてもよい。このようなアシル基のうちではアルキルカルボニル基がよく、特にアセチル基が好ましい。
　例えば、←Ｏ－Ｐｈ－ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ－（アミノ酸残基）ｊ－Ｓｅｒの構造は、チロシンのアミノ基にセリン，又はセリンが末端であるポリペプチドが結合した構造である。このペプチド構造は、←Ｏ－Ｐｈ－ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ－（アミノ酸残基）ｊ－Ｓｅｒの様に、チロシンのカルボキシ末端でポリペプチドを形成してもよい。
　ポリペプチドを形成するアミノ酸は、Ｌ－型、Ｄ－型、ＤＬ－型のいずれであってもよい。
　ポリペプチドとしては、ジペプチドからテトラペプチドであればよい。チロシンとセリン又はトレオニンの中間に結合するアミノ酸としては特に制限はないが、グリシン、アラニン、β－アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、システイン、グルタミン、アスパラギン、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸であればよい。アミノ酸として好ましいものは、グリシン、アラニン、β－アラニンである。チロシンとセリン又はトレオニンの中間に結合するジアミノ酸としては特に制限はないが、上記アミノ酸から構成されるジアミノ酸であればよい。アミノ酸として好ましいものは、グリシン－グリシン、グリシン－アラニン、グリシン－β－アラニン、アラニン－グリシン、アラニン－アラニン、アラニン－β－アラニン、β－アラニン－グリシン、β－アラニン－アラニン、β－アラニン－β－アラニンである。
　リンカーを構成するフェニル基上に存在しているＲ１、Ｒ２及びＲ３のうちのいずれか１個は、－Ｌ１－（ＣＨ２）ｍ－Ｌ２－Ｌ３－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）n1－（ＣＨ２）n2－Ｏ→で示される構造でリンカー機能を果たす。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の内の２個はフェニル基上の置換基である。このような置換基としては、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルコキシ基、ハロゲン原子、炭素数１から９のアルキル基を有するアルキルカルボニルアミノ基、及び置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルキル基を含むアルキルカルボニル基からなる群の基から選ばれる基であればよい。
　Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の内の２個が置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルキル基であるとき、アルキル基としては、直鎖状又は分枝鎖状のいずれであってもよい。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、第二級ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基等を挙げることができる。アルキル基が置換基を有するとき、置換基としては、水酸基、アミノ基、ハロゲン原子、炭素数１から６のアルキルチオ基、炭素数１から６のアルコキシ基、カルボキシ基、炭素数１から６のアルコキシ基を含有するアルコキシカルボニル基からなる群の基から選ばれる基１又は１以上の基を置換基として有していてもよい。置換基が１以上の場合は、同一であっても異なっていてもいずれでもよい。水酸基又はアミノ基がアルキル基の置換基のとき、これらはアルキル基の末端の炭素原子上に置換したものがより好ましい。水酸基を有するアルキル基としてヒドロキシメチル基、２－ヒドロキシエチル基、２－ヒドロキシプロピル基、３－ヒドロキシプロピル基が好ましい。ハロゲン原子をアルキル基の置換基として有する場合、アルキル基は、炭素数１から６の直鎖状又は分枝状のいずれでもよいが、より好ましくはメチル基又はエチル基上にハロゲン原子を有するものであり、特にメチル基が好ましい。ハロゲン原子がアルキル基の置換基であるとき、ハロゲン原子としてはフッ素原子が好ましい。フッ素原子の数は、モノ置換からパーフルオロ置換までのいずれでもよい。モノフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、及び２，２，２－トリフルオロエチル基を例示することができる。モノフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、及びトリフルオロメチル基が好ましい。炭素数１から６のアルキルチオ基及び炭素数１から６のアルコキシ基としては、直鎖状又は分枝鎖状のいずれであってもよく、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、第二級ブチル基等を挙げることができる。カルボキシ基又は炭素数１から６のアルコキシ基を含有するアルコキシカルボニル基がアルキル基の置換基のとき、これらはアルキル基の末端の炭素原子上に置換したものがより好ましい。炭素数１から６のアルコキシ基を含有するアルコキシカルボニル基のアルキル基は、直鎖状又は分枝鎖状のいずれであってもよく、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、第二級ブチル基等を挙げることができる。
　Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の内の２個が、置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルコキシ基であるとき、このアルコキシ基は上記に示したアルキル基と酸素原子とから構成されたアルコキシ基であればよい。
　Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の内の２個がハロゲン原子である場合、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子であればよい。これらのうちでは塩素原子またはフッ素原子が好ましく，より好ましくはフッ素原子である。
　Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の内の２個が置換基を有していてもよい炭素数１から９のアルキル基を含むアルキルカルボニル基（脂肪族アシル基）であるとき、このアルキル部分は上記で示した炭素数１から８のアルキル基を含む炭素数９までのアルキル基であればよく、アルキルカルボニル基はこのようなアルキル基とカルボニル基とから構成されるものであればよい。アルキルカルボニル基としては，アセチル基が好ましい。
　Ｒ１、Ｒ２及びＲ３としては、Ｒ１及びＲ３が水素原子であり、Ｒ２が－Ｌ１－（ＣＨ２）ｍ－Ｌ２－Ｌ３－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）n1－（ＣＨ２）n2－Ｏ→で示されるリンカー構造である場合が好ましい。
　さらに、Ｒ１及びＲ３が水素原子であるときに以下の組み合わせが好ましい；
　Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、ｍとｎ2の和が３以上の整数である場合。
　Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、ｍとｎ2の和が８以上の整数である場合。
　Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、ｍが０又は２であり、ｎ2が６以上の整数である場合。
　Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、ｍが０又は２であり、ｎ2が６又は８であるである場合。
　Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、ｍが０又は２であり、ｎ2が８である場合。
　Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、ｍが２であり、ｎ2が８である場合。
　本明細書中においては、上記、標的遺伝子に対するセンス鎖ポリヌクレオチド、及び該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有する２本鎖ポリヌクレオチドを由来とし、このアンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端が、各々においてリン酸ジエステル構造を形成した下記の構造式で示される構造のリンカーによって結合されている１本鎖構造を有することを特徴とし、ポリヌクレオチド－３’－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－［リンカー］－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－５’－ポリヌクレオチドの構造を形成しているポリヌクレオチドを「３Ｌ５－ポリヌクレオチド」ともいう。
　３Ｌ５－ポリヌクレオチドとしては、次式で示される構造のポリヌクレオチドが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
式中、
ｐは、０から４の整数を示し、
ｑは、４から１０の整数を示し、
Ｌ５は、単結合又は－Ｏ－を示し、
Ｌ６は、（ＣＨ２）ｐとの結合を基点として、－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＨ－、又は－ＮＨ－（Ｃ＝Ｏ）－を示し、
Ｌ５のベンゼン環上の結合位置はパラ位又はメタ位であり、
Ｌ５が－Ｏ－であるときは、ｐは１から４の整数を示す。
　さらに、以下の組み合わせがより好ましい；
　ｐとｑの和が３以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である場合。
　ｐとｑの和が８以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である場合。
　ｐが０又は２であり、ｑが６以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である場合。
　ｐが０又は２であり、ｑが６又は８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である場合。
　ｐが０又は２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である場合。
　ｐが２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である場合。
　本明細書中における、「相補的なヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの塩基部分が相補するヌクレオチドのことをいい、例えば、塩基部分がアデニンとチミン、グアニンとシトシン、グアニンと５－メチルシトシン及びアデニンとウラシルであるヌクレオチドは互いに相補的なヌクレオチドである。
　本明細書中における、「相補的なヌクレオチド配列」とは、対象となるヌクレオチド配列に対して、全てが相補的なヌクレオチドからなるヌクレオチド配列に加え、１又は数個のヌクレオチドが相補的なヌクレオチドではないが、ポリヌクレオチド同士が塩基対を形成するヌクレオチド配列も含む。
　本明細書中におけるポリヌクレオチドの２本鎖構造とは、２種のポリヌクレオチドの互いに相補的なヌクレオチド配列同士がワトソン－クリック塩基対を形成し２本鎖の構造を有しているもの及び１本鎖ポリヌクレオチドの内部における相補的な配列同士がワトソン－クリック塩基対を形成し１本鎖ポリヌクレオチド内部において２本鎖構造を有するものもいう。
　本明細書中における３Ｌ５－ポリヌクレオチドは相補的なヌクレオチド同士がワトソン－クリック塩基対を形成し、２本鎖構造を形成する１本鎖ポリヌクレオチドであるが、全てのポリヌクレオチドがワトソン－クリック塩基対を形成していなくてもよい。
　本明細書中では、３Ｌ５－ポリヌクレオチドを構成するポリヌクレオチドのうち、標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列を含むものを標的遺伝子に対するパッセンジャー鎖（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ　ｓｔｒａｎｄ）又はセンス鎖と呼び、標的遺伝子と相補的なヌクレオチド配列を含むものを標的遺伝子に対するガイド鎖（ｇｕｉｄｅ　ｓｔｒａｎｄ）又はアンチセンス鎖と呼ぶ。標的遺伝子に対するアンチセンス鎖は標的遺伝子のｍＲＮＡと相補的なヌクレオチド配列を有する。
　本明細書中において、標的遺伝子「標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる」とは、標的遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド配列と同一の配列からなることをいうが、完全に同一の配列に加え、３Ｌ５－ポリヌクレオチドが標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する限りにおいて、実質的に同一な配列も含む。「標的遺伝子と相補的なヌクレオチド配列からなる」とは、標的遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド配列と相補的な配列からなることをいうが、完全に相補的な配列に加え、３Ｌ５－ポリヌクレオチドが標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する限りにおいて、実質的に同一な配列も含む。また、標的遺伝子にＳＮＰｓ等が知られている場合、それらの変異を有する配列も同一のヌクレオチド配列に含まれる。本明細書中において、標的遺伝子と相補的なヌクレオチド配列を含み標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有するポリヌクレオチドを標的遺伝子に対するポリヌクレオチドという。
　標的遺伝子に対する３Ｌ５－ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する限りにおいて特に制限されないが、例えば、コンピュータソフトウエア（例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標）：ＧＥＮＥＴＹＸ　ＣＯＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ製等。）を用いて標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有すると予想された配列に基づいてセンス鎖及びアンチセンス鎖の配列を決定することによって決定することもできるし、更に選択された配列に基づいて作製した３Ｌ５－ポリヌクレオチドのＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を確認することによって決定することもできる。
　本明細書中において遺伝子発現抑制作用とは、遺伝子の発現を完全に抑制する作用の他に、コントロールに比して遺伝子の発現を減少させる作用も含まれ、遺伝子抑制（gene silencing）も遺伝子発現抑制作用に含まれる。また、本明細書においては、遺伝子発現抑制作用と遺伝子発現抑制活性を同じ意味に用いている。
　ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用は、当業者が通常行う方法で確認することができるが、例えば、標的遺伝子が発現している細胞に標的遺伝子に対する３Ｌ５－ポリヌクレオチドを投与して一定時間経過後の標的遺伝子の翻訳産物であるタンパク質をウエスタンブロット解析によって定量しタンパク質の発現量をコントロールと比較することによって確認することが出来る。また、リアルタイムＰＣＲの手法により標的遺伝子に対する１本鎖ポリヌクレオチド投与後の標的遺伝子の発現量をリアルタイムで測定することによっても確認することができる。
　標的遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド配列と同一又は実質的に同一な配列を有するポリヌクレオチドとは、標的遺伝子のヌクレオチド配列のうち、いずれの部分でもよい１８ヌクレオチド以上の配列と同一又は実質的に同一な配列からなるポリヌクレオチドである。ここで、「実質的に同一な配列」とは、標的遺伝子のヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上さらに好ましくは９０％以上の相同性を有する配列のことをいう。ヌクレオチド配列の相同性はＢＬＡＳＴ（登録商標）等の公知の遺伝子解析ソフトウエアを用いて計算することが出来る。
　本明細書に添付する配列表において、各配列の＜２２３＞の項目中で“ｃｍ”は２’－Ｏ－メチルシチジン（２’－Ｏ－Ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ）を示し、“ｕｍ”は２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－Ｏ－Ｍｅｔｈｙｌｕｒｉｄｉｎｅ）を示し、“ｇｍ”は２’－Ｏ－メチルグアノシン（２’－Ｏ－Ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｏｓｉｎｅ）を示す。
　２．３Ｌ５－ポリヌクレオチド
　本発明における３Ｌ５－ポリヌクレオチドを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖の鎖長は、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する限り、１８ヌクレオチドから、標的遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長までのいかなる長さでもよい。センス鎖としては、１８～２１の鎖長のものが好ましく、１８～１９の鎖長のものが更に好ましい。アンチセンス鎖としては、１９～２１の鎖長のものが好ましく、２１鎖長のものが更に好ましい。３Ｌ５－ポリヌクレオチドはその全体が２本鎖構造である必要はなく５’及び／又は３’末端が一部突出したものも含み、その突出末端は１～５ヌクレオチド、好ましくは１～３ヌクレオチド、さらに好ましくは２ヌクレオチドである。また、最も好ましい例としては、アンチセンス鎖のポリヌクレオチドの３’末端が２ヌクレオチド突出している（オーバーハング構造）構造を有し、１８塩基対を形成しているポリヌクレオチドが挙げられる。
　３Ｌ５－ポリヌクレオチドは、下記の（ａ）～（ｈ）から選択される少なくともいずれか一つの性質を有する。
（ａ）標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する；
（ｂ）ＲＮＡ分解酵素に安定で、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する；
（ｃ）ホスファターゼに対して安定で、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する；
（ｄ）エキソヌクレアーゼに対して安定で、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する；
（ｅ）ＲＮＡ分解酵素、ホスファターゼ及びエキソヌクレアーゼに対して安定で、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する；
（ｆ）アンチセンス鎖がホスファターゼに対して安定で、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する；
（ｇ）アンチセンス鎖がエキソヌクレアーゼに対して安定で、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する；
（ｈ）アンチセンス鎖が５’－３’エキソヌクレアーゼに対して安定で、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する。
　２－１．
　３Ｌ５－ポリヌクレオチドの一例としては、標的遺伝子に対するセンス鎖ポリヌクレオチド、及び該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有する２本鎖ポリヌクレオチドを由来とし、このアンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端が、各々においてリン酸ジエステル構造を形成した下記の構造式で示される構造のリンカーによって結合されている構造を有することが特徴である、すなわち、ポリヌクレオチド－３’－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－［リンカー］－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－５’－ポリヌクレオチドの構造を形成している［ここで，『ポリヌクレオチド－３’』は、ポリヌクレオチドの３’末端の水酸基上の水素原子を持たない構造を表し、『５’－ポリヌクレオチド』は、ポリヌクレオチドの５’末端の水酸基上の水素原子を持たない構造を示す。］ポリヌクレオチドを挙げることができる。
　３Ｌ５－ポリヌクレオチドの他の一例としては、センス鎖及びアンチセンス鎖が１８乃至２３塩基長のからなり、単離された二本鎖構造を有するＲＮＡ分子であって、各ＲＮＡ鎖が１８～２３塩基長を有し、少なくとも１つの鎖が１～３塩基からなる３’突出部を有するものであり、該ＲＮＡ分子は標的特異的なＲＮＡ干渉が可能なものであり、３’突出部を除く該ＲＮＡ分子の１つの鎖が、予め決定したｍＲＮＡ標的分子に対して１００％の同一性を有する配列からなり、かつ、該ｍＲＮＡ標的分子が細胞又は生物中に存在するものである、上記ＲＮＡ分子であり、アンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端が、各々においてリン酸ジエステル構造を形成したリンカーによって結合されている構造を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
　３Ｌ５－ポリヌクレオチドの他の一例としては、センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端が、各々においてリン酸ジエステル構造を形成したリンカーによって結合されている構造を有し、更に以下の（ａ）乃至（ｄ）に示される特徴を有する、ポリヌクレオチド又はその塩を挙げることができる：
５’－（γ－β）９－γ－λｔ－３’（ＩＩ）
５’－β－（γ－β）９－υｕ－３’（ＩＩＩ）
（ａ）γはＲＮＡ、βは２’－ＯＭｅＲＮＡ、λ及びυはＤＮＡを示す；
（ｂ）ｔ及びｕは同一又は異なって、０～５のいずれかの整数を示す；
（ｃ）式（ＩＩＩ）で示されるポリヌクレオチドのうち、（γ－β）９－γは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる；
（ｄ）式（ＩＩ）における（γ－β）９－γと式（ＩＩＩ）におけるβ―（γ－β）９は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる。
　γ、β、λおよびυは、ヌクレオシドユニットを示し、各ヌクレオシド間を結ぶ線はリン酸ジエステル結合またはホスホロチオエート結合を示す。ヌクレオシドユニットとは、上述の「天然型のヌクレオシド」や「糖修飾ヌクレオシド」のような核酸塩基のＮ－グルコシル体でポリヌクレオチドの構成単位を示す。
　３Ｌ５－ポリヌクレオチドの他の一例としては、センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＶ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（Ｖ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端が、各々においてリン酸ジエステル構造を形成したリンカーによって結合されている構造を有し、更に以下の（ａ）乃至（ｄ）に示される特徴を有する、ポリヌクレオチド又はその塩を挙げることができる：
５’－（α－β）９－αｐ－λｔ－３’（ＩＶ）
５’－δｓ－（α－β）９－υｕ－３’（Ｖ）
（ａ）α及びβは異なってＤＮＡ又は２’－ＯＭｅＲＮＡ、δ及びλは同一又は異なってＤＮＡ又は２’－ＯＭｅＲＮＡ、υは同一又は異なってはＤＮＡ、ＲＮＡ及び２’－ＯＭｅＲＮＡから選択されるいずれかのヌクレオチドを示す；
（ｂ）ｐは０又は１の整数を示し、ｔはｐが０のときは０であり、ｐが１のときは０～５のいずれかの整数を示す。ｓは０又は１の整数を示し、ｕは０～５のいずれかの整数を示す。；
（ｃ）式（ＩＶ）で示されるポリヌクレオチドのうち、（α－β）９－αｐは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる；
（ｄ）式（ＩＶ）における（α－β）９と式（Ｖ）における（α－β）９は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる。
　α、β、δおよびλは、ヌクレオシドユニットを示し、各ヌクレオシド間を結ぶ線はリン酸ジエステル結合またはホスホロチオエート結合を示す。ヌクレオシドユニットとは、上述の「天然型のヌクレオシド」や「糖修飾ヌクレオシド」のような核酸塩基のＮ－グルコシル体でポリヌクレオチドの構成単位を示す。
　３Ｌ５－ポリヌクレオチドの他の一例としては、センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＶＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＶＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端が、各々においてリン酸ジエステル構造を形成したリンカーによって結合されている構造を有し、更に、以下の（ａ）乃至（ｄ）に示される特徴を有する、ポリヌクレオチド又はその塩を挙げることができる：
５’－β－（α－β）８－αｐ－λｔ－３’（ＶＩ）
５’－δｓ－（α－β）８－（α―β）－υｕ－３’（ＶＩＩ）
（ａ）α及びβは異なってＤＮＡ又は２’－ＯＭｅＲＮＡ、δ及びλは同一又は異なってＤＮＡ又は２’－ＯＭｅＲＮＡ、υは同一又は異なってはＤＮＡ、ＲＮＡ及び２’－ＯＭｅＲＮＡから選択されるいずれかのヌクレオチドを示す；
（ｂ）ｐは０又は１の整数を示し、ｔはｐが０のときは０であり、ｐが１のときは０～５のいずれかの整数を示す。ｓは０又は１の整数を示し、ｕは０～５のいずれかの整数を示す；
（ｃ）式（ＶＩ）で示されるポリヌクレオチドのうち、β－（α－β）８－αｐは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる；
（ｄ）式（ＶＩ）における（α－β）８と式（ＶＩＩ）における（α－β）８は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる。
　３Ｌ５－ポリヌクレオチドの他の一例としては、センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＶＩＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＸ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端が、各々においてリン酸ジエステル構造を形成したリンカーによって結合されている構造を有し、更に、以下の（ａ）乃至（ｃ）に示される特徴を有する、（１）に記載のポリヌクレオチド又はその塩を挙げることができる：
５’－（α－β）９－３’（ＶＩＩＩ）
５’－β－（α－β）９－（α－β）－３’（ＩＸ）
（ａ）αがＤＮＡ、βが２’－ＯＭｅＲＮＡである；
（ｂ）式（ＩＸ）で示されるポリヌクレオチドのうち、β－（α－β）９は標的遺伝子と相補的なヌクレオチド配列からなる；
（ｃ）式（ＶＩＩＩ）における（α－β）９と式（ＩＸ）における（α－β）９は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる。
　３Ｌ５－ポリヌクレオチドには、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する限りにおいて、３Ｌ５－ポリヌクレオチド中の任意の１～４残基を他の糖修飾ヌクレオチドで置換したものも含まれる。
　糖修飾ヌクレオチドには、本発明の属する技術分野で知られている糖修飾の全ての様式を含む。糖修飾ヌクレオチドは、あらゆる複素環塩基部位及びインターヌクレオシド結合を保持することができ、さらに前記糖修飾とは独立したグループを含む。糖修飾ヌクレオチドのグループは、２’－修飾ヌクレオシド、４’－チオ修飾ヌクレオシド、４’－チオ－２’－修飾ヌクレオシド及び二環式糖修飾ヌクレオシドを含む。
　２’－修飾ヌクレオチドの例としては、ハロ、アリル、アミノ、アジド、Ｏ－アリル、Ｏ－Ｃ１－Ｃ１０アルキル、ＯＣＦ３、Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－ＣＨ３、２’－Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、又はＯ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）であり、各ＲｍとＲｎが個別にＨ、アミノ保護基、又は置換あるいは非置換Ｃ１－Ｃ１０アルキルである。好ましい２’－修飾は－Ｆ、－ＯＣＨ３、又は－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－ＣＨ３である。さらに好ましくは－ＯＣＨ３である。
　４’－チオ修飾ヌクレオシドの例としては、４’－酸素原子が硫黄原子で置換されたβ－Ｄ－リボヌクレオシドを挙げることができる（Ｈｏｓｈｉｋａ，Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．５７９，ｐ．３１１５－３１１８，（２００５）；　Ｄａｎｄｅ，　Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４９，　ｐ．１６２４－１６３４（２００６）；Ｈｏｓｈｉｋａ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ．　８，　ｐ．２１３３－２１３８，（２００７））。
　４’－チオ－２’－修飾ヌクレオシドの例としては、２’－Ｈ、又は、２’－Ｏ－メチルを保持する４’－チオ－２’－修飾ヌクレオシドを挙げることができ（Ｍａｔｓｕｇａｍｉ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　３６，　１８０５　（２００８））。
　二環式糖修飾ヌクレオシドの例としては、リボース環の２原子を架橋することによって形成された第二の環を保持するヌクレオシドを挙げることができ、そのようなヌクレオシドの例としては、２’－酸素原子と４’－炭素原子をメチレン鎖で架橋した２’，４’－ＢＮＡ／ＬＮＡ（ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ／ｌｏｃｋｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ）（Ｏｂｉｋａ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．，　３８，　ｐ．８７３５－　（１９９７）．；　Ｏｂｉｋａ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．，　３９，　ｐ．５４０１－　（１９９８）．；　Ａ．　Ａ．　Ｋｏｓｈｋｉｎ，　Ａ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，　５４，　ｐ．３６０７（１９９８）．；　Ｏｂｉｋａ，　Ｓ．　Ｂｉｏｏｒｇ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．，　９，ｐ．１００１（２００１）．）、２’，４’－ＢＮＡ／ＬＮＡのメチレン鎖を一炭素延ばしたエチレン鎖で架橋したＥＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ）を挙げることができる（Ｍｏｒｉｔａ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｏｒｇ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．　Ｌｅｔｔ．，　１２，　ｐ．７３（２００２）．；　Ｍｏｒｉｔａ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｏｒｇ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．，　１１，ｐ．２２１１（２００３）．）。
　２’－ＯＭｅＲＮＡを含む３Ｌ５－ポリヌクレオチド中の２’－ＯＭｅＲＮＡの任意の１～４残基が糖修飾ヌクレオチドで置換されている場合に、より好ましい糖修飾ヌクレオチドは上記の糖修飾ヌクレオチドのうち、同一又は異なってＥＮＡ又は２’，４’－ＢＮＡ／ＬＮＡである。
　３Ｌ５－ポリヌクレオチドには、ポリヌクレオチド中のＤＮＡの１～４残基が同一又は異なって、ＲＮＡ、ＥＮＡ又は２’，４’－ＢＮＡ／ＬＮＡに置換されているポリヌクレオチドも含まれる。
　２－２　３Ｌ５－ポリヌクレオチドセンス鎖の合成方法
　３Ｌ５－ポリヌクレオチドを構成するポリヌクレオチドの調製方法としては所望のポリヌクレオチドが合成できる限り特に制限はないが、既知の化学合成法（リン酸トリエステル法、ホスホロアミダイト法、又は、Ｈ－ホスホネート法等）を用いることができる。例えば、市販の核酸合成機を用いて、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ合成に使われる試薬を用いて合成することが出来る。
　２－３　３Ｌ５－ポリヌクレオチドの合成方法
　３Ｌ５－ポリヌクレオチドを合成できる限りその製造方法に制限は無いが、例えば、以下の方法により合成することができる。
　２－３－１　Ａ法
　２－３－１－１　Ａ－１工程
　Ａ－１工程の概要を図１に示す。
　本工程は、所望のヌクレオシドが結合したポリマーサポート（１）（Ａ－１法中、Ｔｒ１－Ｏ－Ｙ－ＣＰＧと表す。式中、ＣＰＧは、ポリヌクレオチドと結合しうるリンカーを有するポリマーサポートを示し、Ｙは、５’－及び３’－水酸基を除いた、核酸塩基部のアミノ基が保護されたヌクレオシドユニットを示す。）を用いて、所望のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド類縁体である化合物（２）を製造する工程である（Ａ法中、ＨＯ－Ｗ１－Ｙ－ＣＰＧと表す。式中、Ｗ１－Ｙは、５’－末端及び３’－末端の水酸基を除いた保護されたポリヌクレオチドを表す。Ｔｒ１は、水酸基の保護基を示す。）。
　Ｔｒ１は、核酸の保護基を脱離することなく脱保護が可能な水酸基の保護基であれば、特に限定はないが、例えば、４－メトキシトリチル基、４，４’－ジメトキシトリチル基、ピクシル基、トリチル基、レブリニル基、ビス（トリメチルシリルオキシ）（シクロヘキシルオキシ）シリル基を挙げることができ、好適には、４－メトキシトリチル基、４，４’－ジメトキシトリチル基である。
　核酸塩基部のアミノ基の保護基としては、通常用いられるものであれば特に制限はないが、例えば、ベンゾイル基、イソブチリル基、アセチル基、フェノキシアセチル基、４－（ｔ－ブチル）フェノキシアセチル基、アリルオキシカルボニル基、ｐ－ニトロフェニルエチルカルボニル基が挙げられる。
　ＣＰＧとしては、コントロールド　ポア　グラス、ロング　チェーン　アルキルアミノ　コントロールド　ポア　グラス（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，　１９８４，　ｐｐ８４－１１５），ポリスチレンビーズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．　３４，３３７３（１９９４））等が挙げられる。その際にポリマーサポート上にアミノプロピル基、アミノヘキシル基のようなアミノアルキル基を有するものが挙げられる。
　ポリヌクレオチドと結合しうるリンカーとしては、Ｙの３’位に対して酸素原子を介して、コハク酸を使ってエステル結合した、－ＯＣ（＝Ｏ）－ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）－が使用され、コハク酸の他方のカルボン酸は、ポリマーサポート上のアミノ基とアミド結合をしているものを挙げられる。コハク酸の他に、ザルコシン（－ＯＣ（＝Ｏ）－ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）－）、シュウ酸リンカー（－ＯＣ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）―）等が挙げられる。
　Ｔｒ１－Ｏ－Ｙ－ＣＰＧであって、Ｔｒ１が、４，４’－ジメトシキトリチル基であり、ＣＰＧが、Ｙの３’位に対して酸素原子を介して、コハク酸を使ってエステル結合した、－ＯＣ（＝Ｏ）－ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）－が使用され、コハク酸の他方のカルボン酸がポリマーサポート上のアミノ基とアミド結合をしているものの市販品の例として、Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社の２’－ＯＭｅ－Ａ－ＲＮＡ－ＣＰＧ（２０－３６００－１０）、２’－ＯＭｅ－Ｃ－ＲＮＡ－ＣＰＧ（２０－３６１０－１０）、２’－ＯＭｅ－Ｇ－ＲＮＡ－ＣＰＧ（２０－３６２１－１０）、２’－ＯＭｅ－Ｕ－ＲＮＡ－ＣＰＧ（２０－３６３０－１０）、Ｂｚ－Ａ－ＲＮＡ－ＣＰＧ（２０－３３０３－１０）、Ａｃ－Ｃ－ＲＮＡ－ＣＰＧ（２０－３３１５－１０）、ｉＰｒ－Ｐａｃ－Ｇ－ＲＮＡ－ＣＰＧ（２０－３３２４－１０）、Ｕ－ＲＮＡ－ＣＰＧ（２０－３３３０－１０）、ｄＡ－ＣＰＧ（２０－２０００－１０）、ｄＣ－ＣＰＧ（２０－２０１０－１０）ｄＧ－ＣＰＧ（２０－２０２０－１０）、ｄＴ－ＣＰＧ（２０－２０３０－１０）、等が挙げられる。
　化合物（２）を製造するのに必要なホスホロアミダイト試薬等を使用して、ＤＮＡ自動合成機を用いた通常のホスホロアミダイト法により、化合物（２）を製造する。所望のヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオチド類縁体は、ＤＮＡ合成機、例えばパーキンエルマー社のホスホロアミダイト法によるモデル３９２などを用いて文献（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　１２，　４５３９（１９８４））記載の方法に準じて合成することが出来る。
　また所望により、オリゴヌクレオチド類縁体をチオエート化する場合は、硫黄のほかテトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ、アプライドバイオシステムズ社）、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬、フェニルアセチルジスルフィド／ピリジン－アセトニトリル（１：１　ｖ／ｖ）溶液（Ｒａｖｉｋｕｍａｒ，　Ｖ．Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．（２００６）　１６，ｐ．２５１３－２５１７）等の試薬を用い、文献（Ｔｅｔａｒｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，　３２，　３００５（１９９１）、Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　１１２，　１２５３（１９９０））記載の方法に準じてチオエート誘導体を得る事ができる。
　２－３－２　Ｃ法
　Ｃ法の概要を図２に示す。
　２－３－２－１　Ｃ－１工程
　本工程は、不活性溶剤中、化合物（９）に、脱酸剤の存在下、酸性条件下で除去し得る保護化試薬（好適にはジメトキシトリチルクロリド）を反応させて、化合物（９）の水酸基を保護した化合物（１０）を得る工程である。
　使用される溶剤としては、反応を阻害せず、出発物質をある程度溶解するものであれば特に限定はないがベンゼン、トルエン、キシレンのような芳香族炭化水素類；メチレンクロリド、クロロホルムのようなハロゲン化炭化水素類；エーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタンのようなエーテル類；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ヘキサメチルホスホロトリアミドのようなアミド類；ジメチルスルホキシドのようなスルホキシド類；アセトン、メチルエチルケトンのようなケトン類；ピリジンのような複素環アミン類又はアセトニトリルのようなニトリル類をあげることができ、好適には、複素環アミン類（特にピリジン）をあげられる。
　使用される保護化試薬としては、トリチルクロリド、モノメトキシトリチルクロリド、ジメトキシトリチルクロリド、トリメトキシトリチルクロリドなどのトリチルハライド類があげられるが、好適にはモノメトキシトリチルクロリド、ジメトキシトリチルクロリドである。
　使用される脱酸剤としては反応を阻害せず、生成物及び出発物質を分解しないものであれば特に限定はないが、好適にはピリジン、ジメチルアミノピリジンのような芳香族アミン類である。
　反応温度と反応時間については使用する保護化試薬や脱酸剤の種類によって異なるが、保護化試薬としてジメトキシトリチルクロリドを用いて、ピリジンを溶剤と脱酸剤と兼ねて、使用する場合は室温で２時間である。
　反応終了後、目的の化合物は常法に従って、反応混合物から採取される。例えば、反応混合物を適宜中和し、又、不溶物が存在する場合には濾過により除去した後、水と酢酸エチルのような混和しない有機溶媒を加え、水洗後、目的化合物を含む有機層を分離し、無水硫酸マグネシウム等で乾燥後、溶剤を留去することによって得られる。得られた目的化合物は必要ならば、常法、例えば再結晶、再沈殿又はクロマトグラフィ－等によって更に精製できる。
　２－３－２－２　Ｃ－２工程
　本工程は、不活性溶剤中、化合物（１０）のカルボキシル基に、アミノ基を有しているフェノールと反応させ、アミド結合を有する化合物（１１）を形成させる工程である。
　使用される溶剤としては、反応を阻害しないものであれば特に限定はないが、ベンゼン、トルエン、キシレンのような芳香族炭化水素類；メチレンクロリド、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼンのようなハロゲン化炭化水素類；蟻酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、炭酸ジエチルのようなエステル類、アセトン、メチルエチルケトンメチルイソブチルケトン、イソホロン、シクロヘキサノンのようなケトン類；ニトロエタン、ニトロベンゼンのようなニトロ化合物類；アセトニトリル、イソブチロニトリルのようなニトリル類；ホルムアミド、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド、ヘキサメチルホスホロトリアミドのようなアミド類；ジメチルスルホキシド、スルホランのようなスルホキシド類があげられ、好適にはハロゲン化炭化水素類（特にメチレンクロリド）、アミド類（特にジメチルホルムアミド）である。
　使用されるフェノールとしては、４－アミノフェノール、３－アミノフェノールをあげることができるが、好適には４－アミノフェノールである。
　使用されるアミド形成試薬としては、例えば、Ｎ－ヒドロキシサクシイミド、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ－ヒドロキシ－５－ノルボルネン－２，３－ジカルボキシイミドのようなＮ－ヒドロキシ化合物類；１，１′－オキザリルジイミダゾール、Ｎ，Ｎ′－カルボニルジイミダゾールのようなジイミダゾール化合物類；２，２′－ジピリジルジサルファイドのようなジサルファイド化合物類；Ｎ，Ｎ′－ジサクシンイミジルカーボネートのようなコハク酸化合物類；Ｎ，Ｎ′－ビス（２－オキソ－３－オキサゾリジニル）ホスフィニッククロライドのようなホスフィニッククロライド化合物類；Ｎ，Ｎ′－ジサクシンイミジルオキザレート（ＤＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ジフタールイミジルオキザレート（ＤＰＯ）、Ｎ，Ｎ′－ビス（ノルボルネニルサクシンイミジル）オキザレート（ＢＮＯ）、１，１′－ビス（ベンゾトリアゾリル）オキザレート（ＢＢＴＯ）、１，１′－ビス（６－クロロベンゾトリアゾリル）オキザレート（ＢＣＴＯ）、１，１′－ビス（６－トリフルオロメチルベンゾトリアゾリル）オキザレート（ＢＴＢＯ）のようなオキザレート化合物類、ジシクロヘキシルカーボジイミド（ＤＣＣ）、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカーボジイミド（ＥＤＣ）などのカーボジイミド類があげられ、好適にはジイミダゾール化合物類、カーボジイミド類（特に、ＥＤＣ）である。
　反応補助試薬として、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）を添加してもよい。
　反応温度及び反応時間は、使用されるアミド形成試薬及び溶剤の種類によって異なるが、０℃乃至１００℃で５乃至５０時間、特に４－アミノフェノールとＥＤＣをメチレンクロリド中で使用する場合には室温で１８時間である。
　反応終了後、目的の化合物は常法に従って、反応混合物から採取される。例えば、反応混合物を適宜中和し、又、不溶物が存在する場合には濾過により除去した後、水と酢酸エチルのような混和しない有機溶媒を加え、水洗後、目的化合物を含む有機層を分離し、無水硫酸マグネシウム等で乾燥後、溶剤を留去することによって得られる。得られた目的化合物は必要ならば、常法、例えば再結晶、再沈殿又はクロマトグラフィ－等によって更に精製できる。
　２－３－３　Ｄ法
　Ｄ法の概要を図２に示す。図中、ｎ1、ｎ2、ｍ、及びＬ１は、上記と同じものを示し、具体的には、ｍは、０から４の整数を示し、Ｌ１は、単結合又は－Ｏ－を示す。
　２－３－３－１　Ｄ－１ａ工程
　本工程は、不活性溶剤中、化合物（１２ａ）のアミノ基に、カルボキシル基を有しているフェノールと反応させ、アミド結合を有する化合物（１３ａ）を形成させる工程である。
　使用されるフェノールとしては、３－ヒドロキシフェニル酢酸、４－ヒドロキシフェニル酢酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、３－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、４－（３－ヒドロキシフェニル）吉草酸、４－（４－ヒドロキシフェニル）吉草酸、３-ヒドロキシフェノキシ酢酸、４-ヒドロキシフェノキシ酢酸などをあげることができるが、好適には３－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオン酸である。
　本工程は、Ｃ－２工程と同様の方法で行うことができる。
　２－３－３－２　Ｄ－２ａ工程
　本工程は、不活性溶剤中、化合物（１３ａ）に、脱酸剤の存在下、酸性条件下で除去し得る保護化試薬（好適にはジメトキシトリチルクロリド）を反応させて、化合物（１３ａ）の水酸基を保護した化合物（１４ａ）を得る工程である。
　本工程は、Ｃ－１工程と同様の方法で行うことができる。
　２－３－３－３　Ｄ－１ｂ工程
　本工程は、不活性溶剤中、化合物（１２ｂ）のアミノ基に、カルボキシル基を有しているフェノールと反応させ、アミド結合を有する化合物（１３ｂ）を形成させる工程である。
　使用されるフェノールとしては、３－ヒドロキシフェニル酢酸、４－ヒドロキシフェニル酢酸、３－（３－ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、３－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、４－（３－ヒドロキシフェニル）吉草酸、４－（４－ヒドロキシフェニル）吉草酸、３-ヒドロキシフェノキシ酢酸、４-ヒドロキシフェノキシ酢酸などをあげることができるが、好適には３－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオン酸である。
　本工程は、Ｃ－２工程と同様の方法で行うことができる。
　２－３－３－４　Ｄ－２ｂ工程
　本工程は、不活性溶剤中、化合物（１３ｂ）に、脱酸剤の存在下、酸性条件下で除去し得る保護化試薬（好適にはジメトキシトリチルクロリド）を反応させて、化合物（１３ｂ）の水酸基を保護した化合物（１４ｂ）を得る工程である。
　本工程は、Ｃ－１工程と同様の方法で行うことができる。
　２－３－３－５　Ｄ－１ｃ工程
　本工程は、不活性溶剤中、化合物（１２ａ）のアミノ基に、カルボキシル基を有しているフェノールと反応させ、アミド結合を有する化合物（１３ｃ）を形成させる工程である。
　使用されるフェノールとしては、Ｎ-[(９Ｈ-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]-Ｌ-チロシンをあげることができる。
　本工程は、Ｃ－２工程と同様の方法で行うことができる。
　２－３－３－６　Ｄ－２ｃ工程
　本工程は、不活性溶剤中、化合物（１３ｃ）に、脱酸剤の存在下、酸性条件下で除去し得る保護化試薬（好適にはジメトキシトリチルクロリド）を反応させて、化合物（１３ｃ）の水酸基を保護した化合物（１４ｃ）を得る工程である。
　本工程は、Ｃ－１工程と同様の方法で行うことができる。
　２－３－４　Ｅ法
　Ｅ法の概要を図３に示す。
　２－３－４－１　Ｅ－１工程
　本工程は、不活性溶剤中、化合物（１５）に、脱酸剤の存在下、酸性条件下で除去し得る保護化試薬（好適にはモノメトキシトリチルクロリド）を反応させて、化合物（１５）の水酸基を保護した化合物（１６）を得る工程である。
　本工程は、Ｃ－１工程と同様の方法で行うことができる。
　２－３－４－２　Ｅ－２工程
　本工程は、不活性溶剤中、化合物（１６）のカルボキシル基に、チロシンエステルと反応させ、アミド結合を有する化合物（１７）を形成させる工程である。
　使用されるチロシンエステルとしては、チロシンメチルエステル、チロシンエチルエステルなどをあげることができるが、好適にはチロシンエチルエステルである。
　本工程は、Ｃ－２工程と同様の方法で行うことができる。
　Ｅ法の概要を図３に示す。
　２－３－５　Ｆ法
　Ｆ法の概要を図３に示す。図中、Ａは、－ＣＨ２－、－ＣＨ（ＣＨ３）－、－ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ［ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２］－、及び、－ＣＨ［ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３］－を表す。
　２－３－５－１　Ｆ－１工程
　本工程は、不活性溶剤中、化合物（１８）のアミノ基に、アミノ基がｔ－Ｂｏｃ基で保護されたアミノ酸（１９）と反応させ、アミド結合を有する化合物（２０）を形成させる工程である。
　ｔ－Ｂｏｃ基で保護されたアミノ酸の種類としては、グリシン、アラニン、β―アラニン、ロイシン、イソロイシンなどをあげることができるが、好適には、グリシン、アラニン、β―アラニンである。
　本工程は、Ｃ－２工程と同様の方法で行うことができる。
　２－３－５－２　Ｆ－２工程
　本工程は、不活性溶剤中、化合物（２０）に脱保護化試薬を反応させて、アミノ基の保護基を選択的に除去して、化合物（２１）を製造する工程である。
　使用される溶剤としては、好適には、ベンゼン、トルエン、キシレンのような芳香族炭化水素類；メチレンクロリド、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼンのようなハロゲン化炭化水素類；蟻酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、炭酸ジエチルのようなエステル類；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン、ジエチレングリコールジメチルエーテルのようなエーテル類；メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール、イソブタノール、ｔ－ブタノール、イソアミルアルコール、ジエチレングリコール、グリセリン、オクタノール、シクロヘキサノール、メチルセロソルブ、のようなアルコール類；アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、イソホロン、シクロヘキサノンのようなケトン類；ニトロエタン、ニトロベンゼンのようなニトロ化合物類；アセトニトリル、イソブチロニトリルのようなニトリル類；ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ヘキサメチルホスホロトリアミドのようなアミド類；ジメチルスルホキシド、スルホランのようなスルホキシド類があげられ、さらに好適には、アルコール類（特にメタノール、エタノール）や塩化メチレン及び脱保護化試薬として酢酸を用いる場合は酢酸と水の混液があげられる。
　使用される脱保護化試薬としては、通常用いられるものであれば、特に制限はないが、保護基がｔ－Ｂｏｃ基の場合には、例えば酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、塩酸及び臭化亜鉛のようなルイス酸類があげられ、好適には酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸である。
　反応温度は使用される試薬、原料、溶剤などにより異なるが、通常－１０乃至１００℃であり、好適には０乃至５０℃である。
　反応時間は使用される原料、溶剤、反応温度などにより異なるが、通常１分間乃至５０時間であり、好適には、１分間乃至２４時間である。
　反応終了後、目的の化合物は常法に従って、反応混合物から採取される。
　２－３－５－３　Ｆ－３工程
　本工程は、不活性溶剤中、化合物（２１）のアミノ基に、化合物（１６）と反応させ、アミド結合を有する化合物（２２）を形成させる工程である。
　本工程は、Ｃ－２工程と同様の方法で行うことができる。
　２－３－６　Ｇ法
　Ｇ法の概要を図４に示す。
　２－３－６－１　Ｇ－１工程
　本工程は、Ｃ－２工程で製造される化合物（１１）、Ｄ－２ａ工程で製造される化合物（１４ａ）、Ｄ－２ｂ工程で製造される化合物（１４ｂ）、Ｄ－２ｃ工程で製造される化合物（１４ｃ）、Ｅ－２工程で製造される化合物（１７）、及び、Ｆ－３工程で製造される化合物（２２）のフェノール（図４中、Ｔｒ－Ｏ－Ｘ－Ｈと表す。Ｔｒは、水酸基の保護基を表す。）の水酸基に、アミダイト化に用いるモノ置換―クロロ（アルコキシ）ホスフィン類（図４中、Ｒ５－Ｐ(－Ｏ－Ｒ４)－Ｃｌと表す。）又はジ置換―アルコキシホスフィン類（図４中、（Ｒ５－）２Ｐ(－Ｏ－Ｒ４)と表す。）を反応して、化合物（２３）を製造する工程である。
　Ｔｒは、核酸の保護基を脱離することなく脱保護が可能な水酸基の保護基であれば、特に限定はないが、例えば、４－メトキシトリチル基、４，４’－ジメトキシトリチル基、ピクシル基、トリチル基、レブリニル基、ビス（トリメチルシリルオキシ）（シクロヘキシルオキシ）シリル基を挙げることができ、好適には、４－メトキシトリチル基、４，４’－ジメトキシトリチル基である。
　使用される溶剤としては、反応に影響を与えないものであれば、特に限定はないが、好適には、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジオキサンのようなエーテル類；メチレンクロリド、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼンのようなハロゲン化炭化水素類が挙げられる。
　本工程中のＲ４は、２－シアノエチル基、メチル基、メタンスルホニルエチル基、２，２，２－トリクロロエチル基、アリル基をあげることができ、好適には、シアノエチル基、メチル基である。
　本工程中のＲ５は、モルホリノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジメチルアミノ基を挙げることができ、好適には、ジイソプロピルアミノ基である。
　使用されるモノ置換－クロロ（アルコキシ）ホスフィン類としては、例えば、クロロ（モルホリノ）メトキシホスフィン、クロロ（モルホリノ）シアノエトキシホスフィン、クロロ（ジメチルアミノ）メトキシホスフィン、クロロ（ジメチルアミノ）シアノエトキシホスフィン、クロロ（ジイソプロピルアミノ）メトキシホスフィン、クロロ（ジイソプロピルアミノ）シアノエトキシホスフィンのようなホスフィン類があげられ、好適には、クロロ（モルホリノ）メトキシホスフィン、クロロ（モルホリノ）シアノエトキシホスフィン、クロロ（ジイソプロピルアミノ）メトキシホスフィン、クロロ（ジイソプロピルアミノ）シアノエトキシホスフィンである。
　モノ置換－クロロ（アルコキシ）ホスフィン類を用いる場合には、脱酸剤が使用され、その場合に、使用される脱酸剤としては、ピリジン、ジメチルアミノピリジンのような複素環アミン類、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンのような脂肪族アミン類があげられるが、好適には、脂肪族アミン類（特にジイソプロピルエチルアミン）である。
　使用されるジ置換－アルコキシホスフィン類としては、例えば、ビス（ジイソプロピルアミノ）シアノエトキシホスフィン、ビス（ジエチルアミノ）メタンスルホニルエトキシホスフィン、ビス（ジイソプロピルアミノ）（２，２，２－トリクロロエトキシ）ホスフィン、ビス（ジイソプロピルアミノ）（４－クロロフェニルメトキシ）ホスフィンのようなホスフィン類をあげることができ、好適には、ビス（ジイソプロピルアミノ）シアノエトキシホスフィンである。
　ジ置換－アルコキシホスフィン類を用いる場合には、酸が使用され、その場合に、使用される酸としては、好適には、テトラゾール、酢酸又はｐ－トルエンスルホン酸である。
　反応温度は、特に限定はないが、通常０乃至８０℃であり、好適には、室温である。
　反応時間は、使用する原料、試薬、温度等により異なるが、通常、５分乃至３０時間であり、好適には、室温で反応した場合、３０分乃至１０時間である。
　反応終了後、本反応の目的化合物（７）は、例えば、反応混合物を適宜中和し、又、不溶物が存在する場合には、濾過により除去した後、水と酢酸エチルのような混和しない有機溶媒を加え、水洗後、目的化合物を含む有機層を分離し、無水硫酸マグネシウム等で乾燥後、溶剤を留去することによって得られる。
　得られた目的化合物は必要ならば、常法、例えば、再結晶、再沈殿又はクロマトグラフィ－等によって更に精製できる。
　２－３－６－２　Ｇ－２工程
　本工程は、Ａ－１で製造される化合物（２）にＧ－１で製造される化合物（２３）をＤＮＡ自動合成機を用いた通常のホスホロアミダイト法により化合物（２４）を製造する工程である（図中、Ｗ２は、５’末端、及び３’末端の水酸基を除いた保護されたセンス鎖ポリヌクレオチドを表し、Ｗ１－Ｙは、５’末端、及び３’末端の水酸基を除いた保護されたアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを表し、Ｔｒ１は水酸基の保護基を表す。）。
　Ｔｒ１は、核酸の保護基を脱離することなく脱保護が可能な水酸基の保護基であれば、特に限定はないが、例えば、４－メトキシトリチル基、４，４’－ジメトキシトリチル基、ピクシル基、トリチル基、レブリニル基、ビス（トリメチルシリルオキシ）（シクロヘキシルオキシ）シリル基を挙げることができ、好適には、４－メトキシトリチル基、４，４’－ジメトキシトリチル基である。
　ＤＮＡ自動合成機を用いた通常のホスホロアミダイト法により、化合物（２４）を製造する。所望のヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオチド類縁体は、ＤＮＡ合成機、例えばパーキンエルマー社のホスホロアミダイト法によるモデル３９２などを用いて文献（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　１２，　４５３９（１９８４））記載の方法に準じて合成することが出来る。
　また所望により、オリゴヌクレオチド類縁体をチオエート化する場合は、硫黄のほかテトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ、アプライドバイオシステムズ社）、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬、フェニルアセチルジスルフィド／ピリジン－アセトニトリル（１：１　ｖ／ｖ）溶液（Ｒａｖｉｋｕｍａｒ，　Ｖ．Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．（２００６）　１６，ｐ．２５１３－２５１７）等の試薬を用い、文献（Ｔｅｔａｒｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，　３２，　３００５（１９９１）、Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　１１２，　１２５３（１９９０））記載の方法に準じてチオエート誘導体を得る事ができる。
　２－３－６－３　Ｇ－３工程
　本工程は、Ｇ－２で製造される化合物（２４）のＣＰＧより切り出し、保護基の除去を行い、最終化合物（２５）を製造する工程である（図中、式中、Ｗ２’は、５’末端、及び３’末端の水酸基を除いたセンス鎖ポリヌクレオチドを示し、Ｗ１’－Ｙ’は、５’末端、及び３’末端の水酸基を除いたアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを表す。）。
　用いる塩基としては、濃アンモニア水、メタノール性アンモニア、エタノール性アンモニア、濃アンモニア水―エタノール（３：１Ｖ／Ｖ）混液、濃アンモニア水―４０％メチルアミン水溶液（１：１Ｖ／Ｖ）混液、メチルアミン、０．５Ｍ　ＬｉＯＨ水溶液、３．５Ｍ　トリエチルアミン/メタノール溶液の（１：１０Ｖ／Ｖ）混液を挙げることができ、好適には濃アンモニア水、濃アンモニア水―エタノール混液（３：１Ｖ／Ｖ）である。
　反応温度は、特に限定はないが、通常－５０乃至８０℃であり、好適には室温乃至６０℃である。
　反応時間は、使用する原料、試薬、温度等により異なるが、通常、５分から３０時間であり、好適には、６０℃で反応した場合、５時間である。
　反応終了後、溶剤を留去することによって得られる化合物が、Ｔｒ１が結合している場合、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー（高速液体クロマトグラフィーを含む。）等の各種クロマトグラフィーなどの精製操作で精製することができる。
　Ｔｒ１が、例えば４－メトキシトリチル基、４，４’－ジメトキシトリチル基、ピクシル基、トリチル基等が塩基性条件で脱保護していない場合、Ｆ－２工程と同様の方法の酸性条件でＴｒ１を脱保護することができる。好適には、８０％酢酸水である。
　このようにして得られる化合物（２５）を含む反応混合物を、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー（高速液体クロマトグラフィーを含む。）等の各種クロマトグラフィーなど、通常の核酸の精製に用いられる精製操作で精製することにより、化合物（２５）を得ることができる。
　本方法により、３Ｌ５－ポリヌクレオチド及びセンス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端のリン酸が修飾されていない２本鎖ポリヌクレオチドを取得することができる。
　３Ｌ５－ポリヌクレオチドには、３Ｌ５－ポリヌクレオチドにコレステロールユニット、脂質ユニット又は、ビタミンＥユニットを導入したもの（例えば、Ｌｏｒｅｎｚ，　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｏｒｇ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．　Ｌｅｔｔ．，１４，ｐ．４９７５－４９７７（２００４）；Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，　Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ，４３２，ｐ．１７３－１７８，　（２００４）；　Ｗｏｌｆｒｕｍ，　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　２５，ｐ．１１４９－１１５７，（２００７））Ｋｕｂｏ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，　１７，　ｐ．１－２０，（２００７）；　Ｋｕｂｏ，　Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍ．　３６５，ｐ．５４－６１，（２００８）；　Ｎｉｓｈｉｎａ，　Ｋ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．　Ｔｈｅｒ．　１６，ｐ．７３４－７４０，（２００８）参照。）、及び３Ｌ５－ポリヌクレオチドの末端に、タンパク質に結合する核酸分子であるアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）を結合したものも含む。
　３Ｌ５－ポリヌクレオチドには、３Ｌ５－ポリヌクレオチドとモノクローナル抗体（又はその適切な結合部分）や、タンパク質（又はその適切なオリゴペプチドフラグメント）が結合したものも含む（例えば、Ｓｏｎｇ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　２３，ｐ．７０９－７１７（２００５）；　Ｘｉａ　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｈａｒｍ．　Ｒｅｓ．　２４，ｐ．２３０９－２３１６（２００７）、Ｋｕｍａｒ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ，４４８，ｐ．３９－４３（２００７）参照。）。
　また、３Ｌ５－ポリヌクレオチドには、３Ｌ５－ポリヌクレオチドにカチオニックポリマーを加えることで、正電荷を帯びた複合体としたものも含む（臓器及び細胞への分布を達成することができた例として、Ｌｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｍｅｄ．　７，ｐ．９７７－９８６（２００５），Ｂａｉｇｕｄｅ　ｅｔ　ａｌ．２，ｐ．２３７－２４１，　ＡＣＳ　Ｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｌ．（２００７），Ｙａｄａｖａ　ｅｔ　ａｌ．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　１７，ｐ．２１３－２２２（２００７）参照）。
　３Ｌ５－ポリヌクレオチドには、上記３Ｌ５－ポリヌクレオチドのあらゆる薬学的に許容可能な塩類、エステル、又はそのようなエステルの塩類を含む。
　３Ｌ５－ポリヌクレオチドの薬学的に許容可能な塩類としては、好適にはナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等の金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ－オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ－メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ－ベンジル－フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；弗化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩のようなアリ－ルスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマ－ル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；及び、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩を挙げることができる。
　３Ｌ５－ポリヌクレオチドを含有する組成物は、例えばリポソーム、受容体標的分子、経口、直腸、局所的又は取り込み、分配及び／又は吸収を補助するための他の処方として、他の分子、分子構造又は化合物の混合物と混合される、封入される、共役される。
　３Ｌ５－ポリヌクレオチドを、疾患の予防薬又は治療薬として使用する場合には、前記ポリヌクレオチド、又は、その薬理学上許容される塩を、それ自体あるいは適宜の薬理学的に許容される、賦形剤、希釈剤等と混合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤等により経口的に、又は、注射剤、坐剤、貼付剤、若しくは、外用剤等により非経口的に投与することができる。
　これらの製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトールのような糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、α澱粉、デキストリンのような澱粉誘導体；結晶セルロースのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルランのような有機系賦形剤；及び、軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、珪酸カルシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩誘導体；燐酸水素カルシウムのような燐酸塩；炭酸カルシウムのような炭酸塩；硫酸カルシウムのような硫酸塩等の無機系賦形剤を挙げることができる。）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーズワックス、ゲイ蝋のようなワックス類；硼酸；アジピン酸；硫酸ナトリウムのような硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；ＤＬロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；及び、上記澱粉誘導体を挙げることができる。）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、及び、前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。）、乳化剤（例えば、ベントナイト、ビーガムのようなコロイド性粘土；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムのような金属水酸化物；ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウムのような陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウムのような陽イオン界面活性剤；及び、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルのような非イオン界面活性剤を挙げることができる。）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及び、ソルビン酸を挙げることができる。）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。）、希釈剤等の添加剤を用いて周知の方法で製造される。
　３．３Ｌ５－ポリヌクレオチドの細胞、組織あるいは個体への導入、及び標的遺伝子の発現調節
　上記のように調製された３Ｌ５－ポリヌクレオチドを導入する被導入体としては、標的遺伝子がその細胞内でＲＮＡに転写され得るものであれば、特に制限されない。被導入体としては細胞、組織、あるいは個体を意味する。
　３Ｌ５－ポリヌクレオチドが用いられる細胞としては、生殖系列細胞、体性細胞、分化全能性細胞、多分化能細胞、分割細胞、非分割細胞、実質組織細胞、上皮細胞、不滅化細胞、形質転換細胞、神経細胞又は免疫細胞のいずれのものであってもよい。
　組織としては単一細胞胚又は構成性細胞、又は多重細胞胚、胎児組織等を含む。また、上記分化細胞としては、例えば、脂肪細胞、線維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、神経細胞、グリア、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球、ケラチン生成細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞及び内分泌線又は外分泌腺の細胞等が挙げられる。このような細胞の例としては、ＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＲＩＫＥＮ　Ｃｅｌｌ　ｂａｎｋ）、ショウジョウバエＳ２細胞（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，　ｌ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｅｍｂｒｙｏｌ．　Ｅｘｐ．　Ｍｏｒｐｈ．，　２７，ｐ．３５３－３６５（１９７２）、ヒトＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ－２）、あるいは、ヒトＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ－１５７３）等が好ましく用いられる。
　さらに３Ｌ５－ポリヌクレオチドの被導入体として用いられる個体として、具体的には、植物、動物、原生動物、ウイルス、バクテリア、又は真菌類に属するもの等が挙げられる。植物は単子葉植物、双子葉植物又は裸子植物であってよく、動物は、脊椎動物又は無脊椎動物であってもよい。脊椎動物としてはマウス、ラット、サル、イヌ及びヒトを含む哺乳類が好ましい。
　被導入体への３Ｌ５－ポリヌクレオチドの導入方法としては、被導入体が細胞、あるいは組織の場合は、カルシウムフォスフェート法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ウイルス感染、３Ｌ５－ポリヌクレオチド溶液への浸漬、あるいは形質転換法等が用いられる。また、胚に導入する方法としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション法、あるいはウイルス感染等が挙げられる。被導入体が植物の場合には植物体の体腔又は間質細胞等への注入又は灌流、あるいは噴霧による方法が用いられる。また、動物個体の場合には、経口、局所、皮下、筋肉内及び静脈内投与、非経口、経膣、経直腸、経鼻、経眼、経膜内投与等によって全身的に導入する方法、あるいはエレクトロポレーション法やウイルス感染等が用いられる。経口導入の方法としては、３Ｌ５－ポリヌクレオチドを生物の食物と直接混合する方法を使うこともできる。
　３Ｌ５－ポリヌクレオチドを患者へ導入する方法については、上記に加えてコロイド分散系を用いることができる。
　コロイド分散系は化合物の生体内の安定性を高める効果や、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果が期待される。
　コロイド分散系は、通常用いられるものであれば限定しないが、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを包含する脂質をベースとする分散系を挙げる事ができ、好ましくは、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果のある、複数のリポソーム、人工膜の小胞である（Ｍａｎｎｉｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８８，６，ｐ．６８２－；Ｂｌｕｍｅ　ａｎｄ　Ｃｅｖｃ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，ｐ．９１－；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ　Ｒｅｓ．，１９９４，２３，ｐ．１１９－；Ｃｈｏｎｎ　ａｎｄ　Ｃｕｌｌｉｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９５，６，ｐ．６９８－）。
　０．２－０．４μｍのサイズ範囲をとる単膜リポソームは、巨大分子を含有する水性緩衝液のかなりの割合を被包化し得、化合物はこの水性内膜に被胞化され、生物学的に活性な形態で脳細胞へ輸送される（Ｆｒａｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９８１，６，ｐ．７７－）。
　リポソームの組成は、通常、脂質、特にリン脂質、とりわけ相転移温度の高いリン脂質を１種又はそれ以上のステロイド、特にコレステロールと通常複合したものである。
　リポソーム生産に有用な脂質の例は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルエタノールアミン、セレブロシド及びガングリオシドのようなホスファチジル化合物を包含する。
　特に有用なのはジアシルホスファチジルグリセロールであり、ここでは脂質部分が１４－１８の炭素原子、特に１６－１８の炭素原子を含有し、飽和している（１４－１８の炭素原子鎖の内部に二重結合を欠いている）。
　代表的なリン脂質は、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びジステアロイルホスファチジルコリンを包含する。
　リポソームを包含するコロイド分散系の標的化は、受動的又は能動的のいずれかであってもよい。
　受動的な標的化は、洞様毛細血管を含有する臓器の網内系細胞へ分布しようとするリポソーム本来の傾向を利用することによって達成される。
　一方、能動的な標的化は、例えば、ウイルスのタンパク質コート（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．），１９９３，９０，ｐ．８４７４－）、モノクローナル抗体（又はその適切な結合部分）、糖、糖脂質又はタンパク質（又はその適切なオリゴペプチドフラグメント）のような特定のリガンドをリポソームへ結合させること、又は天然に存在する局在部位以外の臓器及び細胞型への分布を達成するためにリポソームの組成を変えることによってリポソームを修飾する手法等を挙げることができる。
　標的化されたコロイド分散系の表面は様々なやり方で修飾され得る。
　リポソームで標的したデリバリーシステムでは、脂質二重層との緊密な会合において標的リガンドを維持するために、リポソームの脂質二重層へ脂質基が取込まれ得る。
脂質鎖を標的リガンドと結びつけるために様々な連結基が使用され得る。
　３Ｌ５－ポリヌクレオチドのデリバリーが所望される細胞の上に支配的に見出される特定の細胞表面分子に結合する標的リガンドは、例えば、（１）デリバリーが所望される細胞によって支配的に発現される特定の細胞受容体と結合している、ホルモン、成長因子又はその適切なオリゴペプチドフラグメント、又は（２）標的細胞上で支配的に見出される抗原性エピトープと特異的に結合する、ポリクローナル又はモノクローナル抗体、又はその適切なフラグメント（例えば、Ｆａｂ；Ｆ（ａｂ’）２）、であり得る。
２種又はそれ以上の生物活性剤は、単一のリポソーム内部で複合し、投与することもできる。
　内容物の細胞内安定性及び／又は標的化を高める薬剤をコロイド分散系へ追加することも可能である。
　３Ｌ５－ポリヌクレオチド又はその薬理学上許容される塩の使用量は症状、年齢等により異なるが、経口投与の場合には、１回当り下限１ｍｇ（好適には、３０ｍｇ）、上限２０００ｍｇ（好適には、１５００ｍｇ）を、静脈内投与または皮下投与の場合には、１回当り下限０．５ｍｇ（好適には、５ｍｇ）、上限５００ｍｇ（好適には、２５０ｍｇ）を、気管内投与の場合には、１回当り下限０．５ｍｇ（好適には、５ｍｇ）、上限５００ｍｇ（好適には、２５０ｍｇ）を、眼球内投与の場合には、１回当り下限０．０５ｍｇ（好適には、０．５ｍｇ）、上限１０ｍｇ（好適には、５ｍｇ）を、成人に対して、１日当り１乃至３回症状に応じて投与することが望ましい。また、安定性が高められた薬剤の場合は、１週間に１乃至３回、さらに安定性が高められた薬剤の場合は、１ヶ月に１乃至３回症状に応じて投与することが望ましい。
　局所的投与に対する薬学的組成物及び処方は、経皮的パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、飴、坐薬、スプレー、液体及び粉末を含む。
　以下、実施例、参考例及び試験例にて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、下記実施例において、遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）」［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，　Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．　著、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊］に記載の方法により行うか、又は、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。実施例で合成された各ポリヌクレオチドのＸの構造式、質量分析計で測定された各ポリヌクレオチドの分子量の測定値、を表１に示した。
　（参考例１）
ＨＯ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｔ－Ｈ（配列表の配列番号１）（ＣＴ－１６９）の合成
　核酸自動合成機（パーキンエルマー社製　ＡＢＩ　ｍｏｄｅｌ　３９４　ＤＮＡ／ＲＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用い、０．２μｍｏｌスケールのＲＮＡ合成プログラムに従って行った。各合成サイクルにおける溶媒、試薬、ホスホロアミダイトの濃度は天然オリゴデオキシヌクレオチド合成の場合と同じものを用いた。
　デオキシヌクレオシドホスホロアミダイトを用いる場合は、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－６－Ｎ－ベンゾイル－２’－デオキシアデノシン－３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２－Ｎ－イソブチリル－２’－デオキシグアノシン－３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－４－Ｎ－ベンゾイル－２’－デオキシシチジン－３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’－Ｏ－ジメトキシトリチルチミジン－３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）ホスホロアミダイトをＰｒｏｌｉｇｏ社より購入し適宜調整し用いた。
　２’－Ｏ－メチルヌクレオシドホスホロアミダイトを用いる場合は、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－６－Ｎ－ベンゾイル－２’－Ｏ－メチルアデノシン－３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２－Ｎ－イソブチリル－２’－Ｏ－メチルグアノシン－３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－４－Ｎ－アセチル－２’－Ｏ－メチルシチジン－３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２’－Ｏ－メチルウリジン－３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）ホスホロアミダイトをＧｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈより購入し適宜調製し用いた。
　リボヌクレオシドホスホロアミダイトを用いる場合は、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－６－Ｎ－ベンゾイル－２’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）アデノシン－３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２－Ｎ－ジメチルホルムアミジン－２’　－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）グアノシン－３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－４－Ｎ－アセチル－２’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）シチジン－３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）ウリジン－３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）ホスホロアミダイトをＰｒｏｌｉｇｏ社より購入し適宜調製し用いた。
２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレンヌクレオシドホスホロアミダイトを用いる場合は、特許３４２０９８４号の実施例１４（５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン－６－Ｎ－ベンゾイルアデノシン－３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）ホスホロアミダイト）、実施例２７（５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン－２－Ｎ－イソブチリルグアノシン－３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）ホスホロアミダイト）、実施例２２（５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン－４－Ｎ－ベンゾイル－５－メチルシチジン－３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）ホスホロアミダイト）、実施例９（５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン－５－メチルウリジン－３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）ホスホロアミダイト）、の化合物を適宜調製し用いた。
　５’－末端にリン酸基部分がある場合は、フォスファリンク（ＡＢＩ製）を適宜調製し用いた。
　ホスホロアミダイトは、適宜核酸自動合成機に取り付け、所望の配列を有するポリヌクレオチドを合成した。固相担体として、所望のヌクレオシドが結合したＣＰＧ（コントロールド　ポア　グラス；アプライドバイオシステム製、又は、Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ製）０．５μｍｏｌを用い、表記のポリヌクレオチドを合成した。核酸自動合成機の最終工程で、酸処理をしなかった（ジメトキシトリチル基がオリゴヌクレオチド上に結合している）。本ポリヌクレオチドにおいては、アンモニア水で処理した後、逆相ＨＰＬＣ（島津製作所製ＬＣ－１０ＶＰ、カラム（Ｍｅｒｃｋ，　Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ＲＰ－１８ｅ　（４．６×１００ｍｍ））、Ａ溶液：５％アセトニトリル、０．１Ｍ　酢酸トリエチルアミン水溶液（ＴＥＡＡ），　ｐＨ７．０、Ｂ溶液：アセトニトリル、Ｂ％：１０％→６０％（１０ｍｉｎ，　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ）；６０℃；２ｍｌ／ｍｉｎ；２６０ｎｍ）にて精製し、ジメトキシトリチル基を有する目的物のピークを集めた。水を加え、減圧下留去することで、ＴＥＡＡを除いた。ジメトキシトリチル基が結合している場合は、８０％酢酸水溶液（２ｍＬ）を加え、２０分放置することで、ジメトキシトリチル基の脱保護を行った。溶媒を留去したのち、残渣を５００μｌの水に溶解し、酢酸エチルで洗浄し、凍結乾燥後、目的とするオリゴヌクレオチドを得た。また必要に応じて、７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１ｘ　ＴＢＥ、６００Ｖ、４時間）で精製した。電気泳動後、ＵＶランプを用いてバンドを可視化し、ナイフを使ってバンドを切り出し、１ｍＬの０．２Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）の溶液を加えて、一晩放置し、ポリヌクレオチドをゲル片から溶出させた。エタノールを加え、オリゴヌクレオチドを沈殿させ、遠心し回収した。本ポリヌクレオチドの分子量は、負イオンＥＳＩ質量分析により同定した。
分子量：計算値：５７６７．８６、測定値：５７６７．７８
塩基配列：ヒトβ－カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号３１３９－３１５６の配列を含む。
　（実施例１）
ＨＯ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＣＴ－４３７）の合成
　ＣＴ－４３７は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。
　参考例１と同様にＣＴ－４３７を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分に以下のように調製したＸアミダイト試薬をカップリングした。参考例３で取得された化合物（２０ｍｇ）をアセトニトリル：塩化メチレン（１：１ｖ／ｖ）２ｍＬに溶解し、２－ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ　ｔｅｔｒａｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄｉｔｅ　（７４μＬ、０．２３ｍｍｏｌ）、１Ｈ　Ｔｅｔｒａｚｏｌｅ　０．４５Ｍアセトニトリル溶液３６０μＬを加え２時間攪拌した。ＴＬＣで反応の進行を確認後、フィルターろ過を行い、Ｘアミダイト試薬を調製した。ＣＴ－４３７の構造を図６に示す。
　（実施例２）
ＨＯ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＣＴ－４５５）の合成
　実施例１と同様にＣＴ－４５５を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例４で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。
ＣＴ－４５５は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ－４５５の構造を図６に示す。
　（実施例３）
ＨＯ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＣＴ－４５６）の合成
　実施例１と同様にＣＴ－４５６を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例５で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。
　ＣＴ－４５６は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ－４５６の構造を図６に示す。
　（実施例４）
ＨＯ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＣＴ－４４６）の合成
　実施例１と同様にＣＴ－４４６を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例６で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。
　ＣＴ－４４６は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ－４４６の構造を図６に示す。
　（実施例５）
ＨＯ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＣＴ－４４７）の合成
　実施例１と同様にＣＴ－４４７を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例７で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。
　ＣＴ－４４７は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ－４４７の構造を図６に示す。
　（実施例６）
ＨＯ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＣＴ－４４８）の合成
　実施例１と同様にＣＴ－４４８を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例８で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。
　ＣＴ－４４８は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ－４４８の構造を図６に示す。
　（実施例７）
ＨＯ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＣＴ－４４９）の合成
　実施例１と同様にＣＴ－４４９を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例９で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。
　ＣＴ－４４９は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ－４４９の構造を図６に示す。
　（実施例８）
ＨＯ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＣＴ－４５０）の合成
　実施例１と同様にＣＴ－４５０を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例１０で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。
　ＣＴ－４５０は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ－４５０の構造を図６に示す。
　（実施例９）
ＨＯ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＣＴ－４５１）の合成
　実施例９０と同様にＣＴ－４５１を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例１１で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。
　ＣＴ－４５１は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ－４５１の構造を図６に示す。
　（実施例１０）
ＨＯ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＣＴ－４５２）の合成
　実施例１と同様にＣＴ－４５２を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例１２で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。
　ＣＴ－４５２は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ－４５２の構造を図６に示す。
　（実施例１１）
ＨＯ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＣＴ－４５３）の合成
　実施例１と同様にＣＴ－４５３を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例１３で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。
　ＣＴ－４５３は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ－４５３の構造を図６に示す。
　（実施例１２）
ＨＯ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＣＴ－４５４）の合成
　実施例１と同様にＣＴ－４５４を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例１４で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。
　ＣＴ－４５４は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ－４５４の構造を図６に示す。
　（実施例１３）
ＨＯ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＣＴ－４６０）の合成
　実施例１と同様にＣＴ－４６０を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例１７で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。
　ＣＴ－４６０は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ－４６０の構造を図７に示す。
　（実施例１４）
ＨＯ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＣＴ－４６１）の合成
　実施例１と同様にＣＴ－４６１を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例２１で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。
　ＣＴ－４６１は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ－４６１の構造を図７に示す。
　（実施例１５）
ＨＯ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＣＴ－４６２）の合成
　実施例１と同様にＣＴ－４６２を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例２２で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。
　ＣＴ－４６２は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ－４６２の構造を図７に示す。
　（実施例１６）
ＨＯ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＣＴ－４６３）の合成
　実施例１と同様にＣＴ－４６３を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例２３で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。
　ＣＴ－４６３は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ－４６３の構造を図７に示す。
　（実施例１７）
ＨＯ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＣＴ－４６４）の合成
　実施例１と同様にＣＴ－４６４を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例２６で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。
　ＣＴ－４６４は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ－４６４の構造を図７に示す。
　（実施例１８）
ＨＯ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＣＴ－４６５）の合成
　実施例１と同様にＣＴ－４６５を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例２４で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。
　ＣＴ－４６５は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ－４６５の構造を図７に示す。
　（実施例１９）
ＨＯ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＣＴ－４６６）の合成
　実施例１と同様にＣＴ－４６６を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例２５で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。
　ＣＴ－４６６は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ－４６６の構造を図７に示す。
　（実施例２０）
ＨＯ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＣＴ－４６７）の合成
　実施例１と同様にＣＴ－４６７を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例２７で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。
　ＣＴ－４６７は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ－４６７の構造を図７に示す。
　（実施例２１）
ＨＯ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＣＴ－４６８）の合成
　実施例１と同様にＣＴ－４６８を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例２８で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。
　ＣＴ－４６８は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ－４６８の構造を図７に示す。
　（実施例２２）
ＨＯ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＣＴ－４６９）の合成
　実施例１と同様にＣＴ－４６９を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例２９で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。
　ＣＴ－４６９は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ－４６９の構造を図７に示す。
　（実施例２３）
ＨＯ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＣＴ－４７０）の合成
　実施例１と同様にＣＴ－４７０を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例３０で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。
　ＣＴ－４７０は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ－４７０の構造を図７に示す。
　（実施例２４）
ＨＯ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＣＴ－４７１）の合成
　実施例１と同様にＣＴ－４７１を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例３１で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。
　ＣＴ－４７１は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ－４７１の構造を図７に示す。
　（実施例２５）
ＨＯ－Ｇｒｐ－Ｃｒｐ－Ａｒｐ－Ｃｒｐ－Ａｒｐ－Ａｒｐ－Ｇｒｐ－Ａｒｐ－Ａｒｐ－Ｕｒｐ－Ｇｒｐ－Ｇｒｐ－Ａｒｐ－Ｕｒｐ－Ｃｒｐ－Ａｒｐ－Ｃｒｐ－Ａｒｐ－Ａｒｐ－Ｕｒｐ－Ｕｒｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｒｐ－Ｕｒｐ－Ｇｒｐ－Ｕｒｐ－Ｇｒｐ－Ａｒｐ－Ｕｒｐ－Ｃｒｐ－Ｃｒｐ－Ａｒｐ－Ｕｒｐ－Ｕｒｐ－Ｃｒｐ－Ｕｒｐ－Ｕｒｐ－Ｇｐ－Ｕｒｐ－Ｇｒｐ－Ｃｒｐ－Ｕｒｐ－Ｕｒｔ－Ｈ（ＣＴ－４７２）の合成
　実施例１と同様にＣＴ－４７２を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例１４で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。
　ＣＴ－４７２は、配列表の配列番号３に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号４に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ－４７２の構造を図７に示す。
　（実施例２６）
ＨＯ－Ｇｒｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｒｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｒｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｒｐ－Ａｍ１ｐ－Ａｒｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｒｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｒｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｒｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｒｐ－Ａｍ１ｐ－Ａｒｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｕｒｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｕｒｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｒｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｒｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｒｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｕｒｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｕｒｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｒｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｒｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｕｒｐ－Ｕｒｔ－Ｈ（ＣＴ－４７３）の合成
　実施例１と同様にＣＴ－４７３を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例１４で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。
　ＣＴ－４７３は、配列表の配列番号５に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号６に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ－４７３の構造を図７に示す。
　実施例１～１６に記載のポリヌクレオチドのX部分の構造と分子量を表１に示す。表中、Xの末端のメチレン基はセンス鎖ポリヌクレオチドの３’末端に結合してリン酸ジエステル結合を形成し、フェニル基に結合している酸素原子はアンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端に結合してリン酸ジエステル結合を形成する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
 　実施例１７～２６に記載のポリヌクレオチドのX部分の構造と分子量を表２に示す。表中、Xの末端のメチレン基はセンス鎖ポリヌクレオチドの３’末端に結合してリン酸ジエステル結合を形成し、フェニル基に結合している酸素原子はアンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端に結合してリン酸ジエステル結合を形成する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
　（参考例２）
ＨＯ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（配列表の配列番号２）（ＣＴ－１５７）の合成
　参考例１と同様にＣＴ－１５７を合成した。ＣＴ－１５７の構造を図６に示す。
塩基配列：ヒトβ－カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号３１３９－３１５７に相補的な配列を含む。
　（参考例３）
　６－（４，４’－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｏｘｙ）ｈｅｘａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ（７２２　ｍｇ，　１．６７　ｍｍｏｌ，　Ｊ．　Ｏｒｇ．　Ｃｈｅｍ．，　１９９５，　６０，　３３５８-３３６４）をメチレンクロリド２ｍＬに溶解し、４－アミノフェノール（２００　ｍｇ、１．８４　ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２８８　ｍｇ、２．５　ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（２２５　ｍｇ，　２．５　ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２６０μＬ）を加え、一晩撹拌した。反応の終結をＴＬＣで確認後、メチレンクロリド、５％炭酸水素ナトリウム水溶液で分液し、有機相を飽和食塩水で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラム（３０ｇ、２％メタノール／メチレンクロリド）で精製し、アモルファス状の化合物を得た（６４９ｍｇ）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．４３－６．７５（１７Ｈ，ｍ），　３．７８（６Ｈ，ｓ），　３．０８－３．０２（２Ｈ，ｍ），２．３２－２．２８（２Ｈ，ｍ），　１．７３－１．５９（４Ｈ，ｍ），　１．４９－１．３８（２Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ－ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：　５２５　Ｍ＋
　（参考例４）
　８－ｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ　（１００ｍｇ，　０．５９　ｍｍｏｌ）をピリジン１．５ｍＬに溶解し、４，４’－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　（２３７ｍｇ，　０．７　ｍｍｏｌ）を加え、一晩撹拌した。反応の終結をＴＬＣで確認後、メチレンクロリド、水で分液し、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラム（４ｇ、メチレンクロリド）で精製し、アモルファス状の８－（４，４’－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｏｘｙ）ｏｃｔａｎｏｉｃ　ａｃｉｄを得た（３４８ｍｇ）。得られた８－（４，４’－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｏｘｙ）ｏｃｔａｎｏｉｃ　ａｃｉｄをメチレンクロリド１ｍＬに溶解し、４－アミノフェノール（７０．９　ｍｇ、０．６４　ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（１０１．６　ｍｇ、０．８８　ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（７９　ｍｇ，　０．８８６　ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（９２　μＬ）を加え、一晩撹拌した。反応の終結をＴＬＣで確認後、シリカゲルカラム（５　ｇ、３０％→５０％酢酸エチル／ｎ－ヘキサン）で精製し、アモルファス状の化合物を得た（１４８ｍｇ）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．５２－６．５９（１７Ｈ，ｍ），　３．７９（６Ｈ，ｓ），　３．０５－３．０１（２Ｈ，ｍ），２．３１－２．２７（２Ｈ，ｍ），　１．７１－１．５８（４Ｈ，ｍ），　１．３５－１．２４（６Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ－ＭＡＳ（ｍＮＢＡ＋ＫＩ）：　５９２　（Ｍ＋Ｋ）＋
　（参考例５）
　１０－（４，４’－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｏｘｙ）ｄｅｃａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ（０．７０７　ｇ，　１．１９　ｍｍｏｌ，　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，　１９９４，　３５，　２３５３－２３５６）を　メチレンクロリド２ｍＬに溶解し、４－アミノフェノール（１４１．８　ｍｇ、１．２８　ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２０３　ｍｇ、１．７６　ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（１５８　ｍｇ，　１．７６　ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１８３μＬ）を加え、一晩撹拌した。反応の終結をＴＬＣで確認後、シリカゲルカラム（７．５　ｇ、３０％→５０％酢酸エチル／ｎ－ヘキサン）で精製し、アモルファス状の化合物を得た（４８５ｍｇ）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．５２－６．５９（１７Ｈ，ｍ），　３．７８（６Ｈ，ｓ），　３．０４－３．０１（２Ｈ，ｍ），２．３３－２．２９（２Ｈ，ｍ），　１．７４－１．５６（４Ｈ，ｍ），　１．３３－１．２４（１０Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ－ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：　５８０　（Ｍ－Ｈ）＋
　（参考例６）
　４－アミノ－１－ブタノール（１６０．４５　ｍｇ、１．８　ｍｍｏｌ）、４－ヒドロキシ安息香酸（２０７．１８　ｍｇ、１．５　ｍｍｏｌ）に対して、ＥＤＣ（３８３　ｍｇ、２　ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（６７．５　ｍｇ，　０．５　ｍｍｏｌ）がメチレンクロリド３　ｍＬに溶解した溶液を加え、さらにトリエチルアミン（２６０　μＬ）を加え、一晩振とうした。反応の終結をＴＬＣで確認後、シリカゲルカラム（５　ｇ、メチレンクロリド→酢酸エチルで溶出）で精製し、オイル状のアミド化合物を得た（０．２０　ｇ）。これをピリジン１．５　ｍＬに溶解し、４，４’－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　（５００　ｍｇ，　１．５　ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応の終結をＴＬＣで確認後、メタノール０．５　ｍＬを加え、酢酸エチル、５％炭酸水素ナトリウム水溶液で分液し、有機相の溶媒を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラム（１０ｇ、４０％→５０％酢酸エチル／ｎ－ヘキサン）で精製し、アモルファス状の化合物を得た（３２５ｍｇ）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．７０－６．７８（１７Ｈ，ｍ），　６．１１（１Ｈ，　ｂｒｓ），　５．６９（１Ｈ，　ｓ），　３．７８（６Ｈ，ｓ），　３．４４－３．４１（２Ｈ，ｍ），　３．１３－３．１０（２Ｈ，ｍ），　１．７０－１．６９（４Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ－ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：　５１１　Ｍ＋
　（参考例７）
　６－アミノ－１－ヘキサノール（２１０．９４　ｍｇ、１．８　ｍｍｏｌ）、４－ヒドロキシ安息香酸（２０７．１８　ｍｇ、１．５　ｍｍｏｌ）を用いて参考例６と同様に合成し、アモルファス状の化合物を得た（４４５ｍｇ）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．６７－６．７９（１７Ｈ，ｍ），　５．９７（１Ｈ，　ｂｒｓ），　５．５６（１Ｈ，　ｓ），　３．７８（６Ｈ，ｓ），　３．４３－３．３８（２Ｈ，ｍ），　３．０６－３．０２（２Ｈ，ｍ），　１．６３－１．５５（４Ｈ，ｍ），　１．４５－１．３４（４Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ－ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：　５３９　Ｍ＋
　（参考例８）
　８－アミノ－１－オクタノール（２６１．４３　ｍｇ、１．８　ｍｍｏｌ）、４－ヒドロキシ安息香酸（２０７．１８　ｍｇ、１．５　ｍｍｏｌ）を用いて参考例６と同様に合成し、アモルファス状の化合物を得た（４８６ｍｇ）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．６８－６．８０（１７Ｈ，ｍ），　５．９８（１Ｈ，　ｂｒｓ），　５．５４（１Ｈ，　ｓ），　３．７９（６Ｈ，ｓ），　３．４４－３．３９（２Ｈ，ｍ），　３．０４－３．０１（２Ｈ，ｍ），　１．６２－１．５５（４Ｈ，ｍ），　１．３４－１．２４（８Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ－ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：　５６７　Ｍ＋
　（参考例９）
　４－アミノ－１－ブタノール（１６０．４５　ｍｇ、１．８　ｍｍｏｌ）、３－ヒドロキシ安息香酸（２０７．１８　ｍｇ、１．５　ｍｍｏｌ）を用いて参考例６と同様に合成し、アモルファス状の化合物を得た（５６６ｍｇ）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．５２－６．７９（１７Ｈ，ｍ），　６．２５（１Ｈ，　ｂｒｓ），　６．０６（１Ｈ，　ｓ），　３．７８（６Ｈ，ｓ），　３．４７－３．４７－３．４２（２Ｈ，ｍ），　３．１５－３．１２（２Ｈ，ｍ），　１．７２－１．６６（４Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ－ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：　５１１　Ｍ＋
　（参考例１０）
　６－アミノ－１－ヘキサノール（２１０．９４　ｍｇ、１．８　ｍｍｏｌ）、３－ヒドロキシ安息香酸（２０７．１８　ｍｇ、１．５　ｍｍｏｌ）を用いて参考例６と同様に合成し、アモルファス状の化合物を得た（５８０ｍｇ）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．５２－６．８０（１７Ｈ，ｍ），　６．０８（１Ｈ，　ｂｒｓ），　６．０４（１Ｈ，　ｓ），　３．７８（６Ｈ，ｓ），　３．４５－３．４０（２Ｈ，ｍ），　３．０６－３．０３（２Ｈ，ｍ），　１．６５－１．５６（４Ｈ，ｍ），　１．４５－１．３４（４Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ－ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：　５３９　Ｍ＋
　（参考例１１）
　８－アミノ－１－オクタノール（２６１．４３　ｍｇ、１．８　ｍｍｏｌ）、３－ヒドロキシ安息香酸（２０７．１８　ｍｇ、１．５　ｍｍｏｌ）を用いて参考例６と同様に合成し、アモルファス状の化合物を得た（６７５ｍｇ）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．５２－６．８０（１７Ｈ，ｍ），　６．２１（１Ｈ，　ｂｒｓ），　６．１１（１Ｈ，　ｓ），　３．７８（６Ｈ，ｓ），　３．４６－３．４１（２Ｈ，ｍ），　３．０４－３．０１（２Ｈ，ｍ），　１．６３－１．５８（４Ｈ，ｍ），　１．３９－１．３３（８Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ－ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：　５６６　（Ｍ－Ｈ）＋
　（参考例１２）
　４－アミノ－１－ブタノール（１６０．４５　ｍｇ、１．８　ｍｍｏｌ）、３－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオン酸
（２４９．２６　ｍｇ、１．５　ｍｍｏｌ）を用いて参考例６と同様に合成し、アモルファス状の化合物を得た（５４０ｍｇ）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．５２－６．６８（１７Ｈ，ｍ），　５．３７（１Ｈ，　ｂｒｓ），　４．８７（１Ｈ，　ｓ），　３．７９（６Ｈ，ｓ），　３．２１－３．１６（２Ｈ，ｍ），　３．０６－３．０３（２Ｈ，ｍ），　２．８６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５６Ｈｚ），　２．３５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５６Ｈｚ），　１．５４－１．４８（４Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ－ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：　５４０　（Ｍ＋Ｈ）＋
　（参考例１３）
　６－アミノ－１－ヘキサノール（２１０．９４　ｍｇ、１．８　ｍｍｏｌ）、３－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオン酸（２４９．２６　ｍｇ、１．５　ｍｍｏｌ）を用いて参考例６と同様に合成し、アモルファス状の化合物を得た（５５９ｍｇ）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．４４－６．７０（１７Ｈ，ｍ），　５．２１（１Ｈ，ｂｒｓ），　５．０３（１Ｈ，ｓ），　３．７９（６Ｈ，ｓ），　３．１８－３．１３（２Ｈ，ｍ），　３．０５－３．０２（２Ｈ，ｍ），　２．８７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３３Ｈｚ），　２．３９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５６Ｈｚ），　１．５９－１．１３（８Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ－ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：　５６８　（Ｍ＋Ｈ）＋
　（参考例１４）
　８－アミノ－１－オクタノール（２６１．４３　ｍｇ、１．８　ｍｍｏｌ）、３－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオン酸（２４９．２６　ｍｇ、１．５　ｍｍｏｌ）を用いて参考例６と同様に合成し、あめ状の化合物を得た（７２０ｍｇ）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．５２－６．７１（１７Ｈ，ｍ），　５．２６（１Ｈ，ｂｒｓ），　５．１０（１Ｈ，ｓ），　３．７８（６Ｈ，ｓ），　３．２０－３．１５（２Ｈ，ｍ），　３．０５－３．０１（２Ｈ，ｍ），　２．８８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５６Ｈｚ），　２．４１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５６Ｈｚ），　１．６２－１．１７（１２Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ－ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：　５９４　（Ｍ－Ｈ）＋
　（参考例１５）
Ｎ－（４－ｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ）－Ｌ－ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｅｔｈｙｌ　ｅｓｔｅｒ
　Ｌ－チロシン　エチル（４１８ｍｇ，　２ｍｍｏｌ）をピリジン５　ｍＬに溶解し、４－ｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　（７４１　ｍｇ，　２．４　ｍｍｏｌ）を加え、室温で５時間撹拌した。反応の終結をＴＬＣで確認後、酢酸エチル、５％炭酸水素ナトリウム水溶液で分液し、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥後、有溶媒を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラム（３０ｇ、３０％酢酸エチル／ｎ－ヘキサン）で精製し、アモルファス状の化合物を得た（６８７ｍｇ）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．４２－６．７２（１８Ｈ，ｍ），　４．６９（１Ｈ，ｓ），　３．７６（３Ｈ，ｓ），　３．５３－３．３３（３Ｈ，ｍ），　２．９４－２．８１（２Ｈ，ｍ），　２．５８（１Ｈ，ｄ），　０．８８－０．８５（３Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ－ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：　４８２　（Ｍ＋Ｈ）＋
　（参考例１６）
３－（４－ｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｏｘｙ）－２－ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ－ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　（Ａｃ－Ｓｅｒ（ＭＭＴｒ）－ＯＨ）
　Ｎ－アセチル－Ｄ，Ｌ－セリン（１．７７５ｇ，　１２ｍｍｏｌ）をピリジン２０　ｍＬに溶解し、４－ｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　（４．１ｇ，　１３．２　ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌した。反応の終結をＴＬＣで確認後、酢酸エチル、５％炭酸水素ナトリウム水溶液で分液し、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラム（１２０ｇ、３０％アセトン／ｎ－ヘキサン）で精製し、アモルファス状の化合物を得た（３．９３ｇ）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．４１－６．８１（１４Ｈ，ｍ），　６．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３３Ｈｚ），　４．７０－４．６６（１Ｈ，ｍ），　３．７８（３Ｈ，ｓ），　３．７７－３．７３（１Ｈ，ｍ），　３．４２－３．３８（１Ｈ，ｍ），　２．０２（３Ｈ，ｓ）
ＦＡＢ－ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：　４１９　Ｍ＋
　（参考例１７）
Ａｃ－Ｓｅｒ（ＭＭＴｒ）－Ｔｙｒ－ＯＥｔ
　参考例１６の化合物（６２９　ｍｇ，　１．５　ｍｍｏｌ　Ａｃ－Ｓｅｒ（ＭＭＴｒ）－ＯＨ）をメチレンクロリド３ｍＬに溶解し、Ｌ－チロシン　エチル（３３４ｍｇ，　１．６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（３８３　ｍｇ、２　ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（６７．５　ｍｇ，　０．５　ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２６０μＬ）を加え、４時間撹拌した。反応液をシリカゲルカラム（１５ｇ、４０％→５０％酢酸エチル／ｎ－ヘキサン）で精製し、アモルファス状の化合物を得た（４６０ｍｇ）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．４０－６．６１（１８Ｈ，ｍ），　６．１１－６．０６（１Ｈ，ｍ），　４．８７－４．７７（１Ｈ，ｍ），　４．５６－４．４８（１Ｈ，ｍ），　４．１９－４．０５（２Ｈ，ｍ），　３．７９，３．７８（３Ｈ，ｄｓ），　３．７３－３．５９（１Ｈ，ｍ），　３．１９－２．９６（３Ｈ，ｍ），　１．９３，１．９１　（１Ｈ，ｄｓ），　１．２８－１．２２（３Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ－ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：　６１１　（Ｍ＋Ｈ）＋
　（参考例１８）
ｔ－Ｂｏｃ－βＡｌａ－Ｔｙｒ－ＯＥｔ
Ｎ－ｔ－Ｂｏｃ－β－Ａｌａｎｉｎｅ（２８３ｍｇ，　１．５ｍｍｏｌ，　ｔ－Ｂｏｃ－βＡｌａ－ＯＨ）、Ｌ－チロシン　エチル（３７６　ｍｇ、１．８　ｍｍｏｌ，　Ｈ－Ｔｙｒ－ＯＥｔ）を用いて参考例１７と同様に合成し、アモルファス状の化合物を得た（４９７ｍｇ）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）６．９７－６．７４（４Ｈ，ｍ），　６．０３（１Ｈ，　ｂｒｓ），　５．１１（１Ｈ，　ｂｒｓ），　４．８０（１Ｈ，ｑ，　Ｊ＝６．７２Ｈｚ），　４．２２－４．１５（２Ｈ，ｍ），　３．３７－３．３６（２Ｈ，ｍ），　３．１０－３．０１（２Ｈ，ｍ），　２．３８（２Ｈ，ｍ），　１．４１（９Ｈ，ｓ），　１．２９－１．２３（３Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ－ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：　３８１　（Ｍ＋Ｈ）＋
　（参考例１９）
ｔ－Ｂｏｃ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－ＯＥｔ
Ｎ－ｔ－Ｂｏｃ－Ａｌａｎｉｎｅ（２８３ｍｇ，　１．５ｍｍｏｌ，　ｔ－Ｂｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ）、Ｌ－チロシン　エチル（３７６　ｍｇ、１．８　ｍｍｏｌ）を用いて参考例１７と同様に合成し、アモルファス状の化合物を得た（４９０ｍｇ）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）６．９８－６．７１（４Ｈ，ｍ），　６．４９（１Ｈ，ｄ），　５．１６（１Ｈ，ｓ），　４．９５－４．７６（１Ｈ，ｍ），　４．２０－４．１３（３Ｈ，ｍ），　３．１１－２．９９（２Ｈ，ｍ），　１．４１（９Ｈ，ｓ），　１．３３，１．３１（３Ｈ，ｄｓ），　１．２８－１．２１（３Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ－ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：　３８１　（Ｍ＋Ｈ）＋
　（参考例２０）
ｔ－Ｂｏｃ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－ＯＥｔ
Ｎ－ｔ－Ｂｏｃ－Ｇｌｙｃｉｎｅ（２６３　ｍｇ、１．５　ｍｍｏｌ）、Ｌ－チロシン　エチル（３７６　ｍｇ、１．８　ｍｍｏｌ）を用いて参考例１７と同様に合成し、アモルファス状の化合物を得た（４３４ｍｇ）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）６．９８－６．７２（４Ｈ，ｍ），　６．４６（１Ｈ，　ｄ），　５．０６（１Ｈ，　ｂｒｓ），　４．８４－４．７９（１Ｈ，ｍ），　４．２１－４．１３（２Ｈ，ｍ），　３．８５－３．７２（２Ｈ，ｍ），　３．１０－３．０１（２Ｈ，ｍ），　１．４１（９Ｈ，ｓ），　１．２９－１．２４（３Ｈ，ｍ），　１．２８－１．２１（３Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ－ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：　３６７　（Ｍ＋Ｈ）＋
　（参考例２１）
Ａｃ－Ｓｅｒ（ＭＭＴｒ）－βＡｌａ－Ｔｙｒ－ＯＥｔ
　参考例１８で取得された化合物（４９０ｍｇ，　１．２９ｍｍｏｌ）をメチレンクロリド４ｍＬに溶解し、ＴＦＡ４ｍＬを加え、室温で１５分放置後、溶媒を減圧下濃縮した。残渣をメチレンクロリド３ｍＬ、トリエチルアミン（２６０μＬ）に溶解し、参考例１６で取得された化合物（５４４ｍｇ，　１．３ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（３８３　ｍｇ、２　ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（６７．５　ｍｇ，　０．５　ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２６０μＬ）を加え、一晩撹拌した。反応液をシリカゲルカラム（２０ｇ、８０％酢酸エチル／ｎ－ヘキサン→酢酸エチル）で精製し、アモルファス状の化合物を得た（４６９ｍｇ）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．４１－６．７１（１８Ｈ，ｍ），　４．９１－４．７５（１Ｈ，ｍ），　４．５４－４．４４（１Ｈ，ｍ），　４．２６－４．１５（２Ｈ，ｍ），　３．７８（３Ｈ，ｓ），　３．４６－２．２０（８Ｈ，ｍ），　２．０２，１．９８（３Ｈ，ｄｓ），　１．３４－１．２４（３Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ－ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：　６８２　（Ｍ＋Ｈ）＋
　（参考例２２）
Ａｃ－Ｓｅｒ（ＭＭＴｒ）－Ａｌａ－Ｔｙｒ－ＯＥｔ
　参考例１９の化合物（４８５ｍｇ，　１．２６ｍｍｏｌ）、参考例１６で取得された化合物（５４４ｍｇ，　１．３ｍｍｏｌ）を用いて、参考例２１と同様に合成し、白色固体の化合物を得た（４４８ｍｇ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．４１－６．４９（１８Ｈ，ｍ），　４．８１－４．７１（１Ｈ，ｍ），　４．５６－４．４３（２Ｈ，ｍ），　４．２１－４．１１（２Ｈ，ｍ），　３．７９、３．７８（３Ｈ，ｄｓ），　３．４６－２．８３（４Ｈ，ｍ），　２．０１，１．９４（３Ｈ，ｄｓ），　１．３７－１．１７（６Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ－ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：　６８２　（Ｍ＋Ｈ）＋
　（参考例２３）
Ａｃ－Ｓｅｒ（ＭＭＴｒ）－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－ＯＥｔ
　参考例２０で取得された化合物（４３０ｍｇ，　１．１７ｍｍｏｌ）、参考例１６で取得された化合物（５４４ｍｇ，　１．３ｍｍｏｌ）を用いて、参考例２１と同様に合成し、白色固体の化合物を得た（４８６ｍｇ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）９．２２（１Ｈ，ｓ），　８．４１－８．３４（１Ｈ，ｍ），　８．２４－８．２０（１Ｈ，ｍ），　８．０８－８．０５（１Ｈ，ｍ），　７．３８－６．６３（１８Ｈ，ｍ），　４．６２－４．５８（１Ｈ，　ｍ），　４．３９－４．３３（１Ｈ，　ｍ），　４．０４－３．９７（２Ｈ，ｍ），　３．９２－３．６１（２Ｈ，ｍ），　３．７４（３Ｈ，ｓ），　３．０９－３．０８（１Ｈ，ｍ），　２．８６－２．５０（１Ｈ，ｍ），　１．８５（３Ｈ，ｓ），　１．１１－１．０６（３Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ－ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：　６６８　（Ｍ＋Ｈ）＋
　（参考例２４）
　１０－アミノ－１－デカノール（２６０　ｍｇ、１．５　ｍｍｏｌ）、４－ヒドロキシ安息香酸（２９９　ｍｇ、１．８　ｍｍｏｌ）を用いて参考例６と同様に合成し、アモルファス状の化合物を得た（５６８　ｍｇ）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．６７－６．８０（１７Ｈ，ｍ），　６．０１－５．９９（２Ｈ，ｍ），　３．７８（６Ｈ，ｓ），　３．４５－３．４０（２Ｈ，ｍ），　３．０２（２Ｈ，ｔ、Ｊ＝６．６４Ｈｚ），　１．６３－１．２４（１４Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ－ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：　５９５　Ｍ＋
　（参考例２５）
　１０－アミノ－１－デカノール（２６０　ｍｇ、１．５　ｍｍｏｌ）、３-(４-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸（２４９　ｍｇ、１．８　ｍｍｏｌ）を用いて参考例６と同様に合成し、あめ状の化合物を得た（４１１　ｍｇ）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．４５－６．７１（１７Ｈ，ｍ），　５．２７（１Ｈ，ｂｒｓ），　５．０３（１Ｈ，ｓ），　３．７９（６Ｈ，ｓ），　３．２１－３．１６（２Ｈ，ｍ），３．０３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６４Ｈｚ），２．８８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５６Ｈｚ），　２．４１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５６Ｈｚ），　１．６２－１．１７（１４Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ－ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：　６４６　（Ｍ＋Ｎａ）＋
　（参考例２６）
　８－アミノ－１－オクタノール（２１８　ｍｇ、１．５　ｍｍｏｌ）、(４-ヒドロキシフェノキシ)酢酸（３０３　ｍｇ、１．８　ｍｍｏｌ）を用いて参考例６と同様に合成し、あめ状の化合物を得た（４８９　ｍｇ）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．４５－６．７４（１７Ｈ，ｍ），　６．５６（１Ｈ，ｂｒｓ），　４．９５（１Ｈ，ｓ），４．４６（２Ｈ，ｓ），　３．７９（６Ｈ，ｓ），３．３４－３．２９（２Ｈ，ｍ），　３．０３（２Ｈ，ｔ、Ｊ＝６．６４Ｈｚ），　１．６３－１．２４（１２Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ－ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：　５９６　（Ｍ－Ｈ）＋
　（参考例２７）
　１０－アミノ－１－デカノール（２６０　ｍｇ、１．５　ｍｍｏｌ）、(４-ヒドロキシフェノキシ)酢酸（３０３　ｍｇ、１．８　ｍｍｏｌ）を用いて参考例６と同様に合成し、あめ状の化合物を得た（５７９　ｍｇ）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．４５－６．７５（１７Ｈ，ｍ），　６．５６（１Ｈ，ｂｒｓ），　５．０２（１Ｈ，ｓ），４．４２（２Ｈ，ｓ），　３．７９（６Ｈ，ｓ），３．３５－３．３０（２Ｈ，ｍ），　３．０３（２Ｈ，ｔ、Ｊ＝６．６４Ｈｚ），　１．６３－１．２４（１４Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ－ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：　６２４　（Ｍ－Ｈ）＋
　（参考例２８）
　（ＰＥＯ）３－ｍｏｎｏ-ａｍｉｎｅ（ＣＨＥＭ－ＩＰＥＸ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ、２２４　ｍｇ、１．５　ｍｍｏｌ）、４－ヒドロキシ安息香酸（２９９　ｍｇ、１．８　ｍｍｏｌ）を用いて参考例６と同様に合成し、アモルファス状の化合物を得た（５２０　ｍｇ）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．５８－６．６４（１７Ｈ，ｍ），　６．６１（１Ｈ，ｂｒｓ），　５．８１（１Ｈ，ｓ），　３．７８（６Ｈ，ｓ），３．７１－３．６０（１０Ｈ，ｍ），　３．２３（２Ｈ，ｔ、Ｊ＝５．２７Ｈｚ）
ＦＡＢ－ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：　５７１　Ｍ＋
　（参考例２９）
　（ＰＥＯ）３－ｍｏｎｏ-ａｍｉｎｅ（ＣＨＥＭ－ＩＰＥＸ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ、２２４　ｍｇ、１．５　ｍｍｏｌ）、３-(４-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸（２４９　ｍｇ、１．８　ｍｍｏｌ）を用いて参考例６と同様に合成し、あめ状の化合物を得た（５４３　ｍｇ）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．４６－６．６８（１７Ｈ，ｍ），　５．８８（１Ｈ，ｂｒｓ），　５．３０（１Ｈ，ｓ），　３．７７（６Ｈ，ｓ），３．６７－３．６４（４Ｈ，ｍ），３．５８－３．５６（２Ｈ，ｍ），３．５１－３．４７（２Ｈ，ｍ），３．４３－３．３８（２Ｈ，ｍ），３．２６－３．２３（２Ｈ，ｍ），２．８３－２．８１（２Ｈ，ｍ），　２．２７（２Ｈ，ｔ、Ｊ＝７．７９Ｈｚ）
ＦＡＢ－ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：　６２２　（Ｍ＋Ｎａ）＋
　（参考例３０）
　（ＰＥＯ）３－ｍｏｎｏ-ａｍｉｎｅ（ＣＨＥＭ－ＩＰＥＸ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ、２２４　ｍｇ、１．５　ｍｍｏｌ）、(４-ヒドロキシフェノキシ)酢酸（３０３　ｍｇ、１．８　ｍｍｏｌ）を用いて参考例６と同様に合成し、あめ状の化合物を得た（４７１　ｍｇ）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．５２－６．６８（１８Ｈ，ｍ），　５．０５（１Ｈ，ｓ），　４．３９（２Ｈ，ｓ），　３．７８（６Ｈ，ｓ），　３．６７－３．５１（１０Ｈ，ｍ），　３．２３（２Ｈ，ｔ、Ｊ＝５．２７Ｈｚ）
ＦＡＢ－ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：　６００　（Ｍ－Ｈ）＋
　（参考例３１）
　８－アミノ－１－オクタノール（２１８　ｍｇ、１．５　ｍｍｏｌ）、Ｎ-[(９Ｈ-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]-Ｌ-チロシン（Ｎ－Ｆｍｏｃ－Ｌ－チロシン、７２６　ｍｇ、１．８　ｍｍｏｌ）を用いて参考例６と同様に合成し、アモルファス状の化合物を得た（３５８　ｍｇ）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．７７－６．７１（２５Ｈ，ｍ），　５．４６（１Ｈ，ｂｒｓ），　５．３９（１Ｈ，ｂｒｓ），５．０６（１Ｈ，ｓ），　４．４３－４．１８（４Ｈ，ｍ），　３．７８（６Ｈ，ｓ），　３．１２－３．０２（６Ｈ，ｍ），　１．６２－１．１２（１２Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ－ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：　８３３　Ｍ＋
　（参考例３２）
ＨＯ－Ｇｒｐ－Ｃｒｐ－Ａｒｐ－Ｃｒｐ－Ａｒｐ－Ａｒｐ－Ｇｒｐ－Ａｒｐ－Ａｒｐ－Ｕｒｐ－Ｇｒｐ－Ｇｒｐ－Ａｒｐ－Ｕｒｐ－Ｃｒｐ－Ａｒｐ－Ｃｒｐ－Ａｒｐ－Ａｒｐ－Ｕｒｐ－Ｕｒｔ－Ｈ（配列表の配列番号７）（ＣＴ－１０６）の合成
　参考例１と同様にＣＴ－１０６を合成した。但し、目的配列を有する保護されたポリヌクレオチド類縁体をアンモニア水：エタノール溶液（３：１ｖ／ｖ）２　ｍＬで５５℃、１６時間処理することによってオリゴマーを支持体から切り出すとともに、リン酸基の保護基のシアノエチル基と核酸塩基上の保護基をはずした。ＣＰＧをろ過して除き、エタノールで洗浄し、ろ液と洗液と合わせて、溶媒を減圧下留去した。残った残渣に、Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ　ｔｒｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｉｄｅを０．３ｍＬ加え、室温で１９時間放置後、精製した。ＣＴ－１０６の構造を図１３に示す。
分子量：計算値：６７２７．１６、測定値：６７２６．７３
塩基配列：ヒトβ－カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号３１３９－３１５７の配列を含む。
　（参考例３３）
ＨＯ－Ｕｒｐ－Ｕｒｐ－Ｇｒｐ－Ｕｒｐ－Ｇｒｐ－Ａｒｐ－Ｕｒｐ－Ｃｒｐ－Ｃｒｐ－Ａｒｐ－Ｕｒｐ－Ｕｒｐ－Ｃｒｐ－Ｕｒｐ－Ｕｒｐ－Ｇｒｐ－Ｕｒｐ－Ｇｒｐ－Ｃｒｐ－Ｕｒｐ－Ｕｒｔ－Ｈ（配列表の配列番号８）（ＣＴ－０４１）の合成
　参考例３２と同様にＣＴ－０４１を合成した。ＣＴ－０４１の構造を図１３に示す。
分子量：計算値：６５６５．８８、測定値：６５６５．３４
塩基配列：ヒトβ－カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号３１３９－３１５７に相補的な配列を含む。
　（参考例３４）ＣＴ－００１
ＨＯ－Ｇｒｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｒｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｒｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｒｐ－Ａｍ１ｐ－Ａｒｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｒｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｒｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｒｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｒｐ－Ａｍ１ｐ－Ａｒｐ－Ｔｐ－Ｔｔ－Ｈ（配列表の配列番号９）（ＣＴ－００１）の合成
　参考例３２と同様にＣＴ－００１を合成した。ＣＴ－００１の構造を図１３に示す。
分子量：計算値：６８４９．４６、測定値：６８５０．８
塩基配列：ヒトβ－カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号３１３９－３１５７の配列を含む。
　（参考例３５）ＣＴ－００５
ＨＯ－Ｕｍ１ｐ－Ｕｒｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｕｒｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｒｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｒｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｒｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｕｒｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｕｒｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｒｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｒｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｔｔ－Ｈ（配列表の配列番号１０）（ＣＴ－００５）の合成
　参考例３２と同様にＣＴ－００５を合成した。ＣＴ－００５の構造を図１３に示す。
分子量：計算値：６７０２．２０、測定値：６７０２．２
塩基配列：ヒトβ－カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号３１３９－３１５７に相補的な配列を含む。
　参考例３～１４、１７及び２１～２３に記載の化合物の構造を図５に示し、参考例２４～３１に記載の化合物の構造を図１０に示す。
　（実施例２７）２本鎖構造形成のためのアニーリング
　上記、参考例１及び参考例２の組み合わせで、センス鎖及びアンチセンス鎖を３００ｐｍｏｌずつ１つのチューブに入れて、減圧下乾燥し、３０μＬのｓｉＲＮＡ　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ）を加え、６５℃、１分間加温した後、室温に５分間放置し、センス鎖及びアンチセンス鎖をアニーリングさせ、１０μＭの２本鎖ポリヌクレオチド溶液を得た。
　２本鎖ポリヌクレオチドは、センス鎖、アンチセンス鎖の組み合わせのみで表すこともある。すなわち、例えば、ＣＴ－１６９／ＣＴ－１５７の組み合わせからなる２本鎖ポリヌクレオチドは、単に、「ＣＴ１６９／ＣＴ１５７」または、「ＣＴ１６９／１５７」とも表す。）
　本方法により、図６及び７に示す、２本鎖ポリヌクレオチド及びアンチセンス鎖の５’とセンス鎖の３’がリン酸ジエステル結合を介してリンカーで結合している３Ｌ５－ポリヌクレオチドを取得することができる。
　（試験例１）
　以下のように１本鎖又は２本鎖ポリヌクレオチドによるヒトβ－カテニン遺伝子発現抑制活性の強さを比較した。
　（１）トランスフェクション
　ヒト大腸癌ＳＷ４８０細胞株（ヒト大腸腺癌由来）を、１０％　Ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中に１０００００ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に調製した。そして、１２穴平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に１ｍＬずつ播種し、３７℃、５．０％炭酸ガス下で１日間培養した。リポフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を７．５μＬ、１本鎖又は２本鎖ポリヌクレオチド溶液を最終濃度が、０．３、０．０３、及び０．００３ｎＭとなるようにＯＰＴＩ－ＭＥＭ培地中で混合し、２０分室温で静置した。各ウェルに混合液を添加して、さらに３日間培養を継続した。
　（２）リアルタイムＰＣＲ
　トランスフェクション後、ウェルより培養上清を除いて、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）でｍＲＮＡを抽出した。得られたｍＲＮＡをｉＳｃｒｉｐｔＴＭｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）にて説明書の記載に従い０．５μｇＲＮＡよりｃＤＮＡを調製した。次に、リアルタイムＰＣＲのためにヒトβ－カテニン遺伝子ＰＣＲプライマー（ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｔ　ＩＤ：　ＨＡ１３５６６４、タカラバイオ社製）、内部標準としてヒト－ＧＡＰＤＨ遺伝子に対するＰＣＲプライマー（ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｔ　ＩＤ：　ＨＡ０６７８１２、タカラバイオ社製）及びＰＣＲに必要な薬剤を含むリアルタイムＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて次のようにｍＲＮＡの定量を行った。
βカテニン遺伝子　ID：HA135664
フォワードプライマー　5'-TCTGAGGACAAGCCACAAGATTACA-3'（配列番号１１）
リバースプライマー　5'-TGGGCACCAATATCAAGTCCAA-3'（配列番号１２）
ＧＡＰＤＨ遺伝子　ID：HA067812
フォワードプライマー　5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'（配列番号１３）
リバースプライマー　5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'（配列番号１４）
　９６穴ＰＣＲプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）１ウェルあたり、リアルタイムＰＣＲキットに含まれる２×ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ　ＳＹＢＲ　ＧＲＥＥＮ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘを２５μＬ、ＲＮａｓｅ―Ｆｒｅｅ　Ｗａｔｅｒを１８μＬ、各ＰＣＲプライマーを５μＬ（最終濃度　０．３μＭ）、調製したｃＤＮＡ溶液を２μＬ添加して総量を５０μＬとし、Ｍｘ３０００Ｐ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）にセットし、以下の条件でＰＣＲを実施した。
ＰＣＲ初期活性化　９５℃、１５分間
ＰＣＲ　９４℃、１５秒間
　　　　５６℃、３０秒
　　　　７２℃、３０秒
　このＰＣＲサイクルは４０回繰り返した。検量線は、リポフェクション試薬のみで処理した細胞（＝ＮＣ）から抽出したｍＲＮＡより調製したｃＤＮＡ５倍希釈列したものを用いた。検量線を元に、各トランスフェクタントのヒトβ－カテニンとヒトＧＡＰＤＨを定量し、ヒトβ－カテニン遺伝子量をヒトＧＡＰＤＨ量で割った相対量をグラフにプロットした。リアルタイムＰＣＲはＮ＝２で実施し、グラフにはその平均を示した（ポリヌクレオチドの構造及びそのヌクレオチド配列は図６及び図７に示している。）
　（３）リアルタイムＰＣＲ解析
　（ａ）遺伝子抑制活性解析１
　ＣＴ－１６９／ＣＴ－１５７、ＣＴ－４３７、ＣＴ－４５５、ＣＴ－４５６、ＣＴ－４４６、ＣＴ－４４７、ＣＴ－４４８、ＣＴ－４４９、ＣＴ－４５０、ＣＴ－４５１、ＣＴ－４５２、ＣＴ－４５３、ＣＴ－４５４、及び、ＣＴ－４６１（構造は図６及び図７参照。）のβ－カテニン遺伝子発現抑制活性を調べた。
　図８に示すように、ＣＴ－４３７、ＣＴ－４５５、ＣＴ－４５６、ＣＴ－４４６、ＣＴ－４４７、ＣＴ－４４８、ＣＴ－４４９、ＣＴ－４５０、ＣＴ－４５１、ＣＴ－４５２、ＣＴ－４５３、ＣＴ－４５４、及び、ＣＴ－４６１は、ＣＴ－１６９／ＣＴ－１５７と同様にβ－カテニン遺伝子の発現を強く抑制した。ＣＴ－４４８、及び、ＣＴ－４５４は、ＣＴ－１６９／ＣＴ－１５７よりも強い活性を示した。このことは、アンチセンス鎖５’末端とセンス鎖３’末端とを修飾フェニル基を用いてリン酸基を介して結合した１本鎖ポリヌクレオチドが強い遺伝子の発現抑制活性を有することを示す。
　（試験例２）
　試験例１と同様に１本鎖又は２本鎖ポリヌクレオチドによるヒトβ－カテニン遺伝子発現抑制活性の強さを比較した。
リアルタイムＰＣＲ解析
ａ）遺伝子抑制活性解析１
ＣＴ－１６９／ＣＴ－１５７、ＣＴ－４６０、ＣＴ－４６１、ＣＴ－４６２、及び、ＣＴ－４６３（構造は図７参照。）のβ－カテニン遺伝子発現抑制活性を調べた。
　図９に示すように、ＣＴ－４６０、ＣＴ－４６１、ＣＴ－４６２、及び、ＣＴ－４６３は、ＣＴ－１６９／ＣＴ－１５７よりもβ－カテニン遺伝子の発現を強く抑制した。このことは、アンチセンス鎖５’末端とセンス鎖３’末端を修飾フェニル基を用いてリン酸基を介して結合した１本鎖ポリヌクレオチドが強い遺伝子の発現抑制活性を有することを示す。
　（試験例３）
１本鎖又は２本鎖ポリヌクレオチドによるヒトβ－カテニン遺伝子発現抑制活性の強さを比較した。
（１）トランスフェクション
　ヒト大腸癌ＳＷ４８０細胞株（ヒト大腸腺癌由来）を、１０％　Ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中に１０００００ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に調製した。そして、１２穴平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に１ｍＬずつ播種した。次に、リポフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を７．５μＬ、１本鎖又は２本鎖ポリヌクレオチド溶液を最終濃度が、０．３、０．０３、及び０．００３ｎＭとなるようにＯＰＴＩ－ＭＥＭ培地中で混合し、２０分室温で静置した。各ウェルに混合液を添加し、
３７℃、５．０％炭酸ガス下３日間培養を継続した。
（２）リアルタイムＰＣＲ
　試験例１と同様の方法で行った。
（３）リアルタイムＰＣＲ解析
a）遺伝子抑制活性解析1
ＣＴ－１６９／ＣＴ－１５７、ＣＴ－４４８、ＣＴ－４５４、ＣＴ－４６４、ＣＴ－４６５、ＣＴ－４６６、ＣＴ－４６７、ＣＴ－４６８、ＣＴ－４６９、ＣＴ－４７０、及び、ＣＴ－４７１（構造は図１１参照。）のβ－カテニン遺伝子発現抑制活性を調べた。
　図１２に示すように、ＣＴ－４７０は、ＣＴ－１６９／ＣＴ－１５７と同様にβ－カテニン遺伝子の発現を強く抑制した。ＣＴ－４４８、ＣＴ－４５４、ＣＴ－４６４、ＣＴ－４６５、ＣＴ－４６６、ＣＴ－４６７、ＣＴ－４６８、ＣＴ－４６９、及び、ＣＴ－４７１は、ＣＴ－１６９／ＣＴ－１５７よりも強い活性を示した。このことは、アンチセンス鎖５’末端とセンス鎖３’末端を修飾フェニル基を用いてリン酸基を介して結合した１本鎖ポリヌクレオチドが強い遺伝子の発現抑制活性を有することを示す。
b）遺伝子抑制活性解析２
ＣＴ－１０６／ＣＴ－０４１、及び、ＣＴ－４７２（構造は図１３参照。）のβ－カテニン遺伝子発現抑制活性を調べた。
図１４に示すように、ＣＴ－４７２は、ＣＴ－１０６／ＣＴ－０４１と同様にβ－カテニン遺伝子の発現を強く抑制した。このことは、アンチセンス鎖５’末端とセンス鎖３’末端を修飾フェニル基を用いてリン酸基を介して結合した１本鎖ポリヌクレオチドが強い遺伝子の発現抑制活性を有することを示す。
ｃ）遺伝子抑制活性解析４
ＣＴ－００１／ＣＴ－００５、及び、ＣＴ－４７３（構造は図１３参照。）のβ－カテニン遺伝子発現抑制活性を調べた。
図１４に示すように、ＣＴ－４７３は、ＣＴ－００１／ＣＴ－００５よりもβ－カテニン遺伝子の発現を強く抑制した。このことは、アンチセンス鎖５’末端とセンス鎖３’末端を修飾フェニル基を用いてリン酸基を介して結合した１本鎖ポリヌクレオチドが強い遺伝子の発現抑制活性を有することを示す。
　（実施例２７）
ＨＯ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｕｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ａｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ａｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ａｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＰＫ－００９）の合成
　実施例１と同様にＰＫ－００９を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例１４で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。
　ＰＫ－００９は、配列表の配列番号１７に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号１８に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＰＫ－００９の構造を図１５に示す。
　（実施例２８）
ＨＯ－Ｃｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ａｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＨＳ－００５）の合成
　実施例１と同様にＨＳ－００５を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例１４で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。
　ＨＳ－００５は、配列表の配列番号２３に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２４に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＨＳ－００５の構造を図１６に示す。
　（実施例２９）
ＨＯ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｕｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ａｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＨＳ－００６）の合成
　実施例１と同様にＨＳ－００６を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例１４で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。
　ＨＳ－００６は、配列表の配列番号２５に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２６に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＨＳ－００６の構造を図１６に示す。
　（実施例３０）
ＨＯ－Ｃｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ａｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｓ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＨＳ－００５ｓ）の合成
　実施例１と同様にＨＳ－００５を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例１４で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。本ポリヌクレオチドにおいては、ホスホロチオエート結合部分は、０．２Ｍフェニルアセチルジスルフィド／ピリジン－アセトニトリル（１：１　ｖ／ｖ）溶液３分間処理することで調製した。
　ＨＳ－００５ｓは、配列表の配列番号２７に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２８に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＨＳ－００５ｓの構造を図１６に示す。
　（実施例３１）
ＨＯ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｕｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ａｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｓ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＨＳ－００６ｓ）の合成
　実施例１と同様にＨＳ－００６ｓを合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例１４で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。本ポリヌクレオチドにおいては、ホスホロチオエート結合部分は、０．２Ｍフェニルアセチルジスルフィド／ピリジン－アセトニトリル（１：１　ｖ／ｖ）溶液３分間処理することで調製した。
　ＨＳ－００６ｓは、配列表の配列番号２９に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号３０に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＨＳ－００６ｓの構造を図１６に示す。
　（実施例３２）
ＨＯ－Ｃｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｕｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ａｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ａｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＨＳ－０１２）の合成
　実施例１と同様にＨＳ－０１２を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例１４で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。
　ＨＳ－０１２は、配列表の配列番号３３に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号３４に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＨＳ－０１２の構造を図１９に示す。
　実施例２７～３２に記載のポリヌクレオチドのX部分の構造と分子量を表３に示す。表中、Xの末端のメチレン基はセンス鎖ポリヌクレオチドの３’末端に結合してリン酸ジエステル結合を形成し、フェニル基に結合している酸素原子はアンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端に結合してリン酸ジエステル結合を形成する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
　（参考例３６）
ＨＯ－Ｇｒｐ－Ｃｒｐ－Ｕｒｐ－Ｃｒｐ－Ｇｒｐ－Ｕｒｐ－Ｃｒｐ－Ｕｒｐ－Ａｒｐ－Ｕｒｐ－Ｇｒｐ－Ａｒｐ－Ｃｒｐ－Ａｒｐ－Ａｒｐ－Ｇｒｐ－Ｕｒｐ－Ａｒｐ－Ａｒｐ－Ｕｒｐ－Ｕｒｐ－Ｈ（配列表の配列番号１５）（ＰＫ－００１）の合成
　参考例３２と同様にＰＫ－００１を合成した。ＰＫ－００１の構造を図１５に示す。
分子量：計算値：６６５８．０４、測定値：６６５８．２３
塩基配列：ＲＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０１１１６３）のヌクレオチド番号７４３－７６２の配列を含む。
　（参考例３７）
ＨＯ－Ｕｒｐ－Ｕｒｐ－Ａｒｐ－Ｃｒｐ－Ｕｒｐ－Ｕｒｐ－Ｇｒｐ－Ｕｒｐ－Ｃｒｐ－Ａｒｐ－Ｕｒｐ－Ａｒｐ－Ｇｒｐ－Ａｒｐ－Ｃｒｐ－Ｇｒｐ－Ａｒｐ－Ｇｒｐ－Ｃｒｐ－Ｕｒｐ－Ｇ－Ｈ（配列表の配列番号１６）（ＰＫ－００２）の合成
　参考例３２と同様にＰＫ－００２を合成した。ＰＫ－００２の構造を図１５に示す。
分子量：計算値：６６７４．０４、測定値：６６７３．９１
塩基配列：ＲＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０１１１６３）のヌクレオチド番号７４３－７６２に相補的な配列を含む。
　（参考例３８）
ＨＯ－Ｕｒｐ－Ｇｒｐ－Ａｒｐ－Ｇｒｐ－Ａｒｐ－Ｃｒｐ－Ａｒｐ－Ｃｒｐ－Ａｒｐ－Ｕｒｐ－Ｇｒｐ－Ｇｒｐ－Ｇｒｐ－Ｕｒｐ－Ｇｒｐ－Ｃｒｐ－Ｕｒｐ－Ａｒｐ－Ｕｒｐ－Ｔｐ－Ｔｔ－Ｈ（配列表の配列番号１９）（ＨＳ－００１のセンス鎖）の合成
　参考例３２と同様にＨＳ－００１のセンス鎖を合成した。ＨＳ－００１のセンス鎖の構造を図１６に示す。
分子量：計算値：６７１０．１２、測定値：６７１０．３７
塩基配列：ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ ４７遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００１２３５）のヌクレオチド番号１６０１－１６１９の配列を含む。
　（参考例３９）
ＨＯ－Ａｒｐ－Ｕｒｐ－Ａｒｐ－Ｇｒｐ－Ｃｒｐ－Ａｒｐ－Ｃｒｐ－Ｃｒｐ－Ｃｒｐ－Ａｒｐ－Ｕｒｐ－Ｇｒｐ－Ｕｒｐ－Ｇｒｐ－Ｕｒｐ－Ｃｒｐ－Ｕｒｐ－Ｃｒｐ－Ａｒｐ－Ｔｐ－Ｔｔ－Ｈ（配列表の配列番号２０）（ＨＳ－００１のアンチセンス鎖）の合成
　参考例３２と同様にＨＳ－００１のセンス鎖を合成した。ＨＳ－００１のアンチセンス鎖の構造を図１６に示す。
分子量：計算値：６５９０．０４、測定値：６５８９．８８
塩基配列：ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ ４７遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００１２３５）のヌクレオチド番号１６０１－１６１９のに相補的な配列を含む。
　（参考例４０）
ＨＯ－Ｇｒｐ－Ａｒｐ－Ｇｒｐ－Ａｒｐ－Ｃｒｐ－Ａｒｐ－Ｃｒｐ－Ａｒｐ－Ｕｒｐ－Ｇｒｐ－Ｇｒｐ－Ｇｒｐ－Ｕｒｐ－Ｇｒｐ－Ｃｒｐ－Ｕｒｐ－Ａｒｐ－Ｕｒｐ－Ａｒｐ－Ｔｐ－Ｔｔ－Ｈ（配列表の配列番号２１）（ＨＳ－００２のセンス鎖）の合成
　参考例３２と同様にＨＳ－００１のセンス鎖を合成した。ＨＳ－００１のセンス鎖の構造を図１６に示す。
分子量：計算値：６７３３．１６、測定値：６７３３．２２
塩基配列：ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ ４７遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００１２３５）のヌクレオチド番号１６０２－１６１９の配列を含む。
　（参考例４１）
ＨＯ－Ｕｒｐ－Ａｒｐ－Ｕｒｐ－Ａｒｐ－Ｇｒｐ－Ｃｒｐ－Ａｒｐ－Ｃｒｐ－Ｃｒｐ－Ｃｒｐ－Ａｒｐ－Ｕｒｐ－Ｇｒｐ－Ｕｒｐ－Ｇｒｐ－Ｕｒｐ－Ｃｒｐ－Ｕｒｐ－Ｃｒｐ－Ｔｐ－Ｔｔ－Ｈ（配列表の配列番号２２）（ＨＳ－００２のアンチセンス鎖）の合成
　参考例３２と同様にＨＳ－００１のセンス鎖を合成した。ＨＳ－００１のアンチセンス鎖の構造を図１６に示す。
分子量：計算値：６５６７．００、測定値：６５６６．９９
塩基配列：ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ ４７遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００１２３５）のヌクレオチド番号１６０２－１６１９に相補的な配列を含む。
（試験例４）
　１本鎖又は２本鎖ポリヌクレオチドによるマウスＰＫＲ（Ｅｉｆ２ａｋ２）遺伝子発現抑制活性測定法を示す。
　Ｍｏｕｓｅ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔにリポフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて図１５に記載の１本鎖又は２本鎖ポリヌクレオチドを導入することができる。
　トランスフェクション２４から４８時間後に、細胞からＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ　Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｓｕｐｅｒ　Ｍｉｘ　ｆｏｒ　ｑＲＴ－ＰＣＲ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｃＤＮＡに逆転写する。ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎを用いた定量的ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によりＰＫＲ遺伝子、内部標準として３６Ｂ４遺伝子の発現量を測定する。プライマーは参考文献（Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｔ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ，　１４０，　３３８－３４８　（２０１０））に従い、ＰＫＲ：　５’－ＡＡＡＡＣＡＡＧＧＴＧＧＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＧ－３’と５’－ＧＴＴＧＧＧＣＴＣＡＣＡＣＴＧＴＴＣＡＴＡＡＴ－３’，　３６Ｂ４：　５’－ＣＡＣＴＧＧＴＣＴＡＧＧＡＣＣＣＧＡＧＡＡ－３’と５’－ＡＧＧＧＧＧＡＧＡＴＧＴＴＣＡＧＣＡＴＧＴ－３’を用いる。各サンプルのＰＫＲ　ｍＲＮＡ量を同じサンプルの３６Ｂ４　ｍＲＮＡ量で割ることにより補正し、１本鎖又は２本鎖ポリヌクレオチドによる相対的な遺伝子抑制の強さを測ることができる。
（試験例５）
　以下のように１本鎖又は２本鎖ポリヌクレオチドによるラットＨｓｐ４７（Ｓｅｒｐｉｎｈ１）遺伝子発現抑制活性を測定した。
　（１）トランスフェクション
　１２穴平底プレート（住友ベークライト社製）に２００μＬのＯＰＴＩ－ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と１本鎖又は２本鎖ポリヌクレオチド溶液（最終濃度１及び０．１ｎＭ）を加えた。ネガティブコントロールとしてＱｉａｇｅｎ社より購入したＡｌｌＳｔａｒｓ　Ｎｅｇａｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｉＲＮＡを用いた。そこにリポフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１．２μＬ加え混ぜて１０分間から２０分間室温で静置した。その間にラットＮＲＫ－５２Ｅ細胞株を、１０％　Ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中に６２５００ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に調製した。そして、リポソームーポリヌクレオチド希釈液が入ったプレートの各ウェルに１ｍＬずつ播種し、３７℃、５％二酸化炭素条件下において培養した。
　（２）リアルタイムＰＣＲ
　トランスフェクション２７時間後、細胞からＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。Ｈｓｐ４７　ｍＲＮＡレベルは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ　Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｓｕｐｅｒ　Ｍｉｘ　ｆｏｒ　ｑＲＴ－ＰＣＲ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｃＤＮＡに逆転写をしたのちＴａｑＭａｎプローブを用いた定量的ＰＣＲにより測定した。Ｈｓｐ４７遺伝子に対するプライマー、プローブはＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製　Ａｓｓａｙ　ＩＤ　Ｒｎ００５６７７７７＿ｍ１）を用いた。ＴａｑＭａｎ反応はＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　７９００ＨＴ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。内部標準として同じサンプルのｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の発現レベルを測定した。ｒＲＮＡ測定のプライマー、プローブにはＴａｑＭａｎ　Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ＲＮＡ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　ＶＩＣTM　Ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号：４３０８３２９）を用いた。
　各サンプルのＨｓｐ４７　ｍＲＮＡ量をｒＲＮＡ量で割り、トランスフェクション試薬のみを加えてポリヌクレオチドを加えていない細胞の値を１として相対量を図１７にプロットした（図中、ＡｌｌＳｔａｒｓ　Ｎｅｇａｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｉＲＮＡ（カタログ番号：１０２７２８０）を用いた場合は、ｎａｇｔｉｖｅ　ｓｉと表記した）。図１７は独立した３回の実験結果の平均とそのＳ．Ｄ．値を示した（ポリヌクレオチドの構造及びそのヌクレオチド配列は図１６に示している。）。
　（２）リアルタイムＰＣＲ解析
　（ａ）遺伝子抑制活性解析１
２本鎖ポリヌクレオチドＨＳ－００１、２本鎖ポリヌクレオチドＨＳ－００２、１本鎖ポリヌクレオチドＨＳ－００５、及び、１本鎖ポリヌクレオチドＨＳ－００６（構造は図１６参照。）のラットＨｓｐ４７遺伝子発現抑制活性を調べた。
　図１７に示すように、ＨＳ－００５は、ＨＳ－００１よりもラットＨｓｐ４７遺伝子の発現を強く抑制し、ＨＳ－００６は、ＨＳ－００２よりもラットＨｓｐ４７遺伝子の発現を強く抑制した。この際、ＡｌｌＳｔａｒｓ　Ｎｅｇａｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｉＲＮＡは、Ｈｓｐ４７遺伝子の抑制活性を示さなかった。このことは、アンチセンス鎖５’末端とセンス鎖３’末端を修飾フェニル基を用いてリン酸基を介して結合した１本鎖ポリヌクレオチドが２本鎖ポリヌクレオチドよりも強い遺伝子の発現抑制活性を有することを示す。
（試験例６）
　１本鎖又は２本鎖ポリヌクレオチドによるラットＨｓｐ４７（Ｓｅｒｐｉｎｈ１）遺伝子発現抑制活性を測定した。
　（１）トランスフェクション
　２本鎖ポリヌクレオチドであるＨＳ－００１、ＨＳ－００２、１本鎖ポリヌクレオチドＨＳ－００５ｓ、及び、ＨＳ－００６ｓ（構造は図１６参照。）を用いて、試験例５と同様に行った。但し、ＮＲＫ―５２Ｅ細胞への核酸の導入は、２４穴平底プレート（住友ベークライト社製）を用い、試験例５の半分の量の系で行った。
　（２）リアルタイムＰＣＲ
　試験例５と同様に行った。
　（ａ）遺伝子抑制活性解析１
　２本鎖ポリヌクレオチドであるＨＳ－００１、ＨＳ－００２、１本鎖ポリヌクレオチドＨＳ－００５ｓ、及び、ＨＳ－００６ｓのラットＨｓｐ４７遺伝子発現抑制活性を調べた。
　図１８に示すように、ＨＳ－００５ｓ、及び、ＨＳ－００６ｓは、ＨＳ－００１、及びＨＳ－００２と比較して、同等またはそれ以上にラットＨｓｐ４７遺伝子の発現を強く抑制した。このことは、アンチセンス鎖５’末端とセンス鎖３’末端を修飾フェニル基を用いてリン酸基を介して結合した１本鎖ポリヌクレオチドが２本鎖ポリヌクレオチドよりも強い遺伝子の発現抑制活性を有することを示す。
（試験例７）
　１本鎖又は２本鎖ポリヌクレオチドによるラットＨｓｐ４７（Ｓｅｒｐｉｎｈ１）遺伝子発現抑制活性を測定した。
　（１）トランスフェクション
　国際公開第２０１１/０７２０８２記載の２本鎖ポリヌクレオチドであるｓｉＨＳＰ４７Ｃ（配列表の配列番号３１及び３２、構造は図１９参照。）、及び、１本鎖ポリヌクレオチドＨＳ－０１２（構造は図１９参照。）を用いて、試験例６と同様に行った。
ｓｉＨＳＰ４７Ｃセンス鎖　5'-GGACAGGCCUCUACAACUATT-3'（配列番号３１）
ｓｉＨＳＰ４７Ｃアンチセンス鎖　5'-UAGUUGUAGAGGCCUGUCCTT-3'（配列番号３２）
　（２）リアルタイムＰＣＲ
　試験例５と同様に行った。
　（ａ）遺伝子抑制活性解析１
２本鎖ポリヌクレオチドであるｓｉＨＳＰ４７Ｃ、及び、１本鎖ポリヌクレオチドＨＳ－０１２のラットＨｓｐ４７遺伝子発現抑制活性を調べた。
　図２０に示すように、ＨＳ－０１２は、ｓｉＨＳＰ４７Ｃと比較して、同等またはそれ以上にラットＨｓｐ４７遺伝子の発現を強く抑制した。このことは、アンチセンス鎖５’末端とセンス鎖３’末端を修飾フェニル基を用いてリン酸基を介して結合した１本鎖ポリヌクレオチドが２本鎖ポリヌクレオチドよりも強い遺伝子の発現抑制活性を有することを示す。
　本発明により、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する１本鎖ポリヌクレオチドを提供することができた。また、本発明により、ＲＮＡ分解酵素に対して安定で、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する１本鎖ポリヌクレオチドを提供することができた。
　該１本鎖ポリヌクレオチドは遺伝子の機能解析、医薬品等に利用することが可能であるが、本１本鎖ポリヌクレオチドが利用できる限りにおいてその産業分野は制限されない。
配列番号１：ＣＴ－１６９
配列番号２：ＣＴ－１５７
配列番号３：ＣＴ－４７２のセンス鎖領域
配列番号４：ＣＴ－４７２のアンチセンス鎖領域
配列番号５：ＣＴ－４７３のセンス鎖領域
配列番号６：ＣＴ－４７３のアンチセンス鎖領域
配列番号７：ＣＴ－１０６
配列番号８：ＣＴ－０４１
配列番号９：ＣＴ－００１
配列番号１０：ＣＴ－００５
配列番号１１：βカテニン遺伝子フォワードプライマー
配列番号１２：βカテニン遺伝子リバースプライマー
配列番号１３：ＧＡＰＤＨ遺伝子フォワードプライマー
配列番号１４：ＧＡＰＤＨ遺伝子リバースプライマー
配列番号１５：ＰＫ－００１
配列番号１６：ＰＫ－００２
配列番号１７：ＰＫ－００９のセンス鎖領域
配列番号１８：ＰＫ－００９のアンチセンス鎖領域
配列番号１９：ＨＳ－００１のセンス鎖
配列番号２０：ＨＳ－００１のアンチセンス鎖
配列番号２１：ＨＳ－００２のセンス鎖
配列番号２２：ＨＳ－００２のアンチセンス鎖
配列番号２３：ＨＳ－００５のセンス鎖領域
配列番号２４：ＨＳ－００５のアンチセンス鎖領域
配列番号２５：ＨＳ－００６のセンス鎖領域
配列番号２６：ＨＳ－００６のアンチセンス鎖領域
配列番号２７：ＨＳ－００５ｓのセンス鎖領域
配列番号２８：ＨＳ－００５ｓのアンチセンス鎖領域
配列番号２９：ＨＳ－００６ｓのセンス鎖領域
配列番号３０：ＨＳ－００６ｓのアンチセンス鎖領域
配列番号３１：ｓｉＨＳＰ４７Ｃのセンス鎖
配列番号３２：ｓｉＨＳＰ４７Ｃのアンチセンス鎖
配列番号３３：ＨＳ－０１２のセンス鎖領域
配列番号３４：ＨＳ－０１２のアンチセンス鎖領域

Claims (59)

  1. 　標的遺伝子に対するセンス鎖ポリヌクレオチド、及び該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有するポリヌクレオチドであって、該アンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端と該センス鎖ポリヌクレオチドの３’末端の各々において、リン酸ジエステル構造を形成している次式で示される構造のリンカーによって結合されたポリヌクレオチド又はその塩
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    式中、
    フェニル基に結合している酸素原子は、アンチセンス鎖の５’末端に結合してリン酸ジエステル構造を形成し、
    Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のいずれか１個は、次式で示される構造：
    －Ｌ１－（ＣＨ２）ｍ－Ｌ２－Ｌ３－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）n1－（ＣＨ２）n2－Ｏ→
    を示すが、式中、
    ｍは、０から４の整数を示し、
    ｎ1は、０から４の整数を示し、
    ｎ2は、０又は２から１０の整数を示し、
    Ｌ１は、単結合又は－Ｏ－を示し、
    Ｌ２は、単結合又は－ＣＨ（－ＮＨ－Ｌ４－Ｒ）－を示し、
    Ｌ３は、Ｌ２との結合を基点として、単結合、－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＨ－、又は－ＮＨ－（Ｃ＝Ｏ）－を示すが、
    Ｌ３が単結合以外のとき、ｎ2は、２から１０の整数を示す。
    Ｌ１及びＬ２が単結合であって、ｍが１、ｎ1およびｎ2が０であるときに、Ｌ３－Ｏ→は、
    －ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ－（アミノ酸残基）ｊ－Ｓｅｒ、
    －ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ－（アミノ酸残基）ｊ－Ｔｈｒ、
    －ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ－（アミノ酸残基）ｊ－Ｓｅｒ、又は
    －ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ－（アミノ酸残基）ｊ－Ｔｈｒ、
    を示すが、これらのセリンおよびトレオニンの水酸基部分は、センス鎖ポリヌクレオチドの３’末端のリン酸基と結合しており、さらにセリンおよびトレオニンのアミノ基はアシル基で置換されていてもよく、
    ｊは、０から２の整数を示し、
    Ｌ４は、単結合、－（Ｃ＝Ｏ）－（ＣＨ２）ｋ－ＮＨ－、又は－（Ｃ＝Ｏ）－（ＣＨ２）ｋ－を示し、
    ｋは１から６の整数を示し、
    Ｒは、水素原子、炭素数１から６のアルキル基、飽和又は不飽和であってもよい炭素数２から３０の炭化水素カルボニル基、飽和又は不飽和であってもよい炭素数２から３０の炭化水素オキシカルボニル基を示す。
    Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のうちの残りの２個は、各々独立に、
    水素原子、
    置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルキル基、
    置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルコキシ基、
    ハロゲン原子、
    炭素数１から９のアルキル基を有するアルキルカルボニルアミノ基、及び
    置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルキル基を含むアルキルカルボニル基、
    からなる群の基から選ばれる基を示す。
  2. 　Ｒ１及びＲ３が水素原子である、請求項１に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
  3. 　Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、ｍとｎ2の和が３以上の整数である、請求項２に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
  4. 　Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、ｍとｎ2の和が８以上の整数である、請求項２に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
  5. 　Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、ｍが０又は２であり、ｎ2が６以上の整数である、請求項２に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
  6. 　Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、ｍが０又は２であり、ｎ2が６又は８である、請求項２に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
  7. 　Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、ｍが０又は２であり、ｎ2が８である、請求項２に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
  8. 　Ｒ１及びＲ３が水素原子であり、Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、ｍが２であり、ｎ2が８である、請求項１に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
  9. 　標的遺伝子に対するセンス鎖ポリヌクレオチド、及び該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有するポリヌクレオチドであって、該アンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端と該センス鎖ポリヌクレオチドの３’末端がリン酸ジエステル結合を介してリンカーによって結合された次式で示される構造のポリヌクレオチド又はその塩
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    式中、
    ｐは、０から４の整数を示し、
    ｑは、４から１０の整数を示し、
    Ｌ５は、単結合又は－Ｏ－を示し、
    Ｌ６は、（ＣＨ２）ｐとの結合を基点として、－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＨ－、又は－ＮＨ－（Ｃ＝Ｏ）－を示し、
    Ｌ５のベンゼン環上の結合位置はパラ位又はメタ位であり、
    Ｌ５が－Ｏ－であるときは、ｐは１から４の整数を示す。
  10. 　ｐとｑの和が３以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項９に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
  11. 　ｐとｑの和が８以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項９に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
  12. 　ｐが０又は２であり、ｑが６以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項９に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
  13. 　ｐが０又は２であり、ｑが６又は８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項９に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
  14. 　ｐが０又は２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項９に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
  15. 　ｐが２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項９に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
  16. 　センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、更に以下の（ａ）乃至（ｄ）に示される特徴を有する、請求項１乃至１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩：
    ５’－（γ－β）９－γ－λｔ－３’（ＩＩ）
    ５’－β－（γ－β）９－υｕ－３’（ＩＩＩ）
    （ａ）γはＲＮＡ、βは２’－ＯＭｅＲＮＡ、λ及びυはＤＮＡを示す；
    （ｂ）ｔ及びｕは同一又は異なって、０～５のいずれかの整数を示す。；
    （ｃ）式（ＩＩ）で示されるポリヌクレオチドのうち、（γ－β）９－γは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる；
    （ｄ）式（ＩＩ）における（γ－β）９－γと式（ＩＩＩ）におけるβ―（γ－β）９は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる。
  17. 　センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＶ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（Ｖ）に示すポリヌクレオチドからなり、更に以下の（ａ）乃至（ｄ）に示される特徴を有する、請求項１乃至１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩：
    ５’－（α－β）９－αｐ－λｔ－３’（ＩＶ）
    ５’－δｓ－（α－β）９－υｕ－３’（Ｖ）
    （ａ）α及びβは異なってＤＮＡ又は２’－ＯＭｅＲＮＡ、δ及びλは同一又は異なってＤＮＡ又は２’－ＯＭｅＲＮＡ、υは同一又は異なってはＤＮＡ、ＲＮＡ及び２’－ＯＭｅＲＮＡから選択されるいずれかのヌクレオチドを示す；
    （ｂ）ｐは０又は１の整数を示し、ｔはｐが０のときは０であり、ｐが１のときは０～５のいずれかの整数を示す。ｓは０又は１の整数を示し、ｕは０～５のいずれかの整数を示す。；
    （ｃ）式（ＩＶ）で示されるポリヌクレオチドのうち、（α－β）９－αｐは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる；
    （ｄ）式（ＩＶ）における（α－β）９と式（Ｖ）における（α－β）９は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる。
  18. 　センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＶＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＶＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、更に、以下の（ａ）乃至（ｄ）に示される特徴を有する、請求項１乃至１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩：
    ５’－β－（α－β）８－αｐ－λｔ－３’（ＶＩ）
    ５’－δｓ－（α－β）８－（α―β）－υｕ－３’（ＶＩＩ）
    （ａ）α及びβは異なってＤＮＡ又は２’－ＯＭｅＲＮＡ、δ及びλは同一又は異なってＤＮＡ又は２’－ＯＭｅＲＮＡ、υは同一又は異なってはＤＮＡ、ＲＮＡ及び２’－ＯＭｅＲＮＡから選択されるいずれかのヌクレオチドを示す；
    （ｂ）ｐは０又は１の整数を示し、ｔはｐが０のときは０であり、ｐが１のときは０～５のいずれかの整数を示す。ｓは０又は１の整数を示し、ｕは０～５のいずれかの整数を示す；
    （ｃ）式（ＶＩ）で示されるポリヌクレオチドのうち、β－（α－β）８－αｐは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる；
    （ｄ）式（ＶＩ）における（α－β）８と式（ＶＩＩ）における（α－β）８は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる。
  19. 　αがＤＮＡ、βが２’－ＯＭｅＲＮＡであることを特徴とする、請求項１７又は１８に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
  20. 　λｔ及びυｕが同一又は異なってチミン塩基、アデニン塩基又はグアニン塩基を有するＤＮＡ、又は、ウラシル塩基、アデニン塩基又はグアニン塩基を有する２’－ＯＭｅＲＮＡのいずれかであることを特徴とする、請求項１６乃至１９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
  21. 　ｔが０、ｕが２であることを特徴とする、請求項１６乃至２０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
  22. 　ｐ及びｔが０、ｓが１、ｕが２であることを特徴とする、請求項１７乃至２０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
  23. 　ｐ及びｔが０、ｓが０又は１、ｕが２であり、υ２がＤＮＡ又は２’－ＯＭｅＲＮＡであることを特徴とする、請求項１７乃至２０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
  24. 　センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＶＩＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＸ）に示すポリヌクレオチドからなり、更に、以下の（ａ）乃至（ｃ）に示される特徴を有する、請求項１乃至１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩：
    ５’－（α－β）９－３’（ＶＩＩＩ）
    ５’－β－（α－β）９－（α－β）－３’（ＩＸ）
    （ａ）αがＤＮＡ、βが２’－ＯＭｅＲＮＡである；
    （ｂ）式（ＩＸ）で示されるポリヌクレオチドのうち、β－（α－β）９は標的遺伝子と相補的なヌクレオチド配列からなる；
    （ｃ）式（ＶＩＩＩ）における（α－β）９と式（ＩＸ）における（α－β）９は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる。
  25. 　２’－ＯＭｅＲＮＡの任意の１～４残基がＥＮＡ又は２’，４’－ＢＮＡ／ＬＮＡに置換されていることを特徴とする、請求項１６乃至２４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
  26. 　ＤＮＡの任意の１～４残基がＲＮＡ、ＥＮＡ又は２’，４’－ＢＮＡ／ＬＮＡに置換されていることを特徴とする、請求項１６乃至２５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
  27. 　各ヌクレオチドがリン酸ジエステル結合又はホスホロチオエート結合で結合していることを特徴とする、請求項１乃至２６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
  28. 　請求項１乃至２７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩を有効成分として含有する医薬。
  29. 　遺伝子発現に由来する疾患を治療するための、請求項２８に記載の医薬。
  30. 　請求項１乃至２９から選択されるポリヌクレオチド又はその塩を哺乳動物に投与することによる、標的遺伝子の発現抑制方法。
  31. 　請求項１乃至２７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩を含有する試薬。
  32. 　式（Ｘ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    [式中、Ｔｒは、水酸基の保護基を示し、ｐは、０から４の整数を示し、ｑは、４から１０の整数を示し、Ｌ５は、単結合又は－Ｏ－を示し、Ｌ６は、（ＣＨ２）ｐとの結合を基点として、－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＨ－、又は－ＮＨ－（Ｃ＝Ｏ）－を示し、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置はパラ位又はメタ位である。]を有する化合物又はその塩。
  33. 　Ｔｒが４－メトキシトリチル基、４，４’－ジメトキシトリチル基、ピクシル基、トリチル基、レブリニル基、又はビス（トリメチルシリルオキシ）（シクロヘキシルオキシ）シリル基である、請求項３２に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
  34. 　Ｔｒが４－メトキシトリチル基又は４，４’－ジメトキシトリチル基であり、ｐとｑの和が３以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項３２に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
  35. 　Ｔｒが４－メトキシトリチル基又は４，４’－ジメトキシトリチル基であり、ｐとｑの和が８以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項３２に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
  36. 　Ｔｒが４－メトキシトリチル基又は４，４’－ジメトキシトリチル基であり、ｐが０又は２であり、ｑが６以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項３２に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
  37. 　Ｔｒが４－メトキシトリチル基又は４，４’－ジメトキシトリチル基であり、ｐが０又は２であり、ｑが６又は８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項３２に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
  38. 　Ｔｒが４－メトキシトリチル基又は４，４’－ジメトキシトリチル基であり、ｐが０又は２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項３２に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
  39. 　Ｔｒが４－メトキシトリチル基又は４，４’－ジメトキシトリチル基であり、ｐが２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項３２に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
  40. 　Ｔｒが４，４’－ジメトキシトリチル基であり、ｐが２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項３２に記載の化合物又はその塩。
  41. 　標的遺伝子に対するセンス鎖ポリヌクレオチド、及び該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有するポリヌクレオチドであって、該アンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端と該センス鎖ポリヌクレオチドの３’末端がリン酸ジエステル結合を介してＸによって結合された、式（ＸＩ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    を有する化合物[式中、Ｗ２’は、５’末端、及び３’末端の水酸基を除いたセンス鎖ポリヌクレオチドを示し、Ｗ１’－Ｙ’は、５’末端、及び３’末端の水酸基を除いたアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを示し、Ｘは、式（ＸＩＩ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    [式中、ｐは、０から４の整数を示し、ｑは、４から１０の整数を示し、Ｌ５は、単結合又は－Ｏ－を示し、Ｌ６は、（ＣＨ２）ｐとの結合を基点として、－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＨ－、又は－ＮＨ－（Ｃ＝Ｏ）－を示し、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置はパラ位又はメタ位であり、Ｌ５が－Ｏ－であるときは、ｐは１から４の整数を示す。] を示し、末端のメチレン基は該センス鎖ポリヌクレオチドの３’末端に結合してリン酸ジエステル結合を形成し、フェニル基に結合している酸素原子は該アンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端に結合してリン酸ジエステル結合を形成する。]を製造する方法であって、
    （i）式Ｔｒ－Ｏ－Ｘ－Ｈ[式中、Ｔｒは、水酸基の保護基を示し、Ｘの－（ＣＨ２）ｑ－はＴｒ－Ｏ－に結合し、フェニル基に結合している酸素原子は水素に結合する。]を有する化合物の水酸基を、式（ＸＩＩＩ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
    又は、式（ＸＩＶ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
    [式中、Ｒ４は、２－シアノエチル基、メチル基、メタンスルホニルエチル基、２，２，２－トリクロロエチル基、又は４－クロロフェニルメチル基を示し、Ｒ５は、モルホリノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、又はジメチルアミノ基を示す。] を有する化合物と反応させて、式（ＸＶ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
    を有する化合物を製造する工程；
    （ii）上記（i）で得られた化合物をホスホロアミダイト法により、式ＨＯ－Ｗ１－Ｙ－ＣＰＧ[式中、Ｗ１－Ｙは、５’末端、及び３’末端の水酸基を除いた保護されたアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを示し、ＣＰＧは、ポリヌクレオチドと結合しうるリンカーを有するポリマーサポートを示す。]を有する化合物と反応させて、続いて、ホスホロアミダイト法により、式Ｔｒ１－Ｏ－Ｗ２－Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ４）－Ｏ－[式中、Ｔｒ１は、水酸基の保護基を示し、Ｗ２は、５’末端、及び３’末端の水酸基を除いた保護されたセンス鎖ポリヌクレオチドを示す。]部分を製造し、式（ＸＶＩ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
    を有する化合物を製造する工程；及び、
    （iii）上記（ii）で得られた化合物をＣＰＧより切り出し、保護基の除去を行う工程からなる、式（ＸＩ）を有する化合物を製造する方法。
  42. 　Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４－メトキシトリチル基、４，４’－ジメトキシトリチル基、ピクシル基、トリチル基、レブリニル基、又はビス（トリメチルシリルオキシ）（シクロヘキシルオキシ）シリル基である、請求項４１に記載の方法。
  43. 　Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４－メトキシトリチル基又は４，４’－ジメトキシトリチル基であり、ｐとｑの和が３以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項４１に記載の方法。
  44. 　Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４－メトキシトリチル基又は４，４’－ジメトキシトリチル基であり、ｐとｑの和が８以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項４１に記載の方法。
  45. 　Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４－メトキシトリチル基又は４，４’－ジメトキシトリチル基であり、ｐが０又は２であり、ｑが６以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項４１に記載の方法。
  46. 　Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４－メトキシトリチル基又は４，４’－ジメトキシトリチル基であり、ｐが０又は２であり、ｑが６又は８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項４１に記載の方法。
  47. 　Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４－メトキシトリチル基又は４，４’－ジメトキシトリチル基であり、ｐが０又は２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項４１に記載の方法。
  48. 　Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４－メトキシトリチル基又は４，４’－ジメトキシトリチル基であり、ｐが２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項４１に記載の方法。
  49. 　Ｔｒ及びＴｒ１が、４，４’－ジメトキシトリチル基であり、ｐが２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＨ－であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項４１に記載の方法。
  50. 　Ｒ４が２－シアノエチル基、メチル基、メタンスルホニルエチル基、２，２，２－トリクロロエチル基、又は４－クロロフェニルメチル基であり、Ｒ５がモルホリノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、又はジメチルアミノ基である、請求項４１乃至４９のいずれか１項に記載の方法。
  51. 　Ｒ４が２－シアノエチル基又はメチル基であり、Ｒ５がモルホリノ基又はジイソプロピルアミノ基である、請求項４１乃至４９のいずれか１項に記載の方法。
  52. 　式（ＸＩＩＩ）を有する化合物が、クロロ（モルホリノ）メトキシホスフィン、クロロ（モルホリノ）シアノエトキシホスフィン、クロロ（ジイソプロピルアミノ）メトキシホスフィン又はクロロ（ジイソプロピルアミノ）シアノエトキシホスフィンである、請求項４１乃至４９のいずれか１項に記載の方法。
  53. 　式（ＸＩＶ）を有する化合物が、ビス（ジイソプロピルアミノ）シアノエトキシホスフィンである、請求項４１乃至４９のいずれか１項に記載の方法。
  54. 　下記から選択されるポリヌクレオチド又はその塩
    ＨＯ－Ｃｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ａｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＨＳ－００５）、
    ＨＯ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｕｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ａｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＨＳ－００６）、
    ＨＯ－Ｃｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｇｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ａｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ｔｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｓ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＨＳ－００５ｓ）、又は、
    ＨＯ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｇｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｇｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｕｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ｘ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－Ｕｍ１ｐ－Ａｐ－Ｕｍ１ｐ－Ａｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｃｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｃｐ－Ａｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｃｍ１ｐ－Ｔｐ－Ｇｍ１ｐ－Ｔｓ－Ｕｍ１ｔ－Ｈ（ＨＳ－００６ｓ）
    [式中、Ａｐ、Ｇｐ、Ｃｐ、Ｔｐ、Ｔｓ、Ａｍ１ｐ、Ｇｍ１ｐ、Ｃｍ１ｐ、Ｕｍ１ｐ、Ｕｍ１ｔは次式で示される構造のヌクレオシド、又は、ヌクレオチドを示し、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
    Ｘの前方は、標的遺伝子に対するセンス鎖ポリヌクレオチドを示し、Ｘの後方は、該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを示し、Ｘは式（ＸＶＩＩ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
    で示される構造のリンカーを示し、末端のメチレン基は該センス鎖ポリヌクレオチドの３’末端に結合してリン酸ジエステル結合を形成し、フェニル基に結合している酸素原子は該アンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端に結合してリン酸ジエステル結合を形成する。]。
  55. 　請求項５４に記載のポリヌクレオチド又はその塩を有効成分として含有する医薬。
  56. 　Ｈｓｐ４７遺伝子の発現に由来する疾患を治療するための、請求項５５に記載の医薬。
  57. 　Ｈｓｐ４７遺伝子の発現に由来する疾患が線維症である、請求項５６に記載の医薬。
  58. 　請求項５４に記載のポリヌクレオチド又はその塩を哺乳動物に投与することによる、Ｈｓｐ４７遺伝子の発現抑制方法。
  59. 　請求項５４に記載のポリヌクレオチド又はその塩を含有する試薬。
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