DE69227380T3

DE69227380T3 - Verfahren zur bestimmung und behandlung von alzheimer-krankheit

Info

Publication number: DE69227380T3
Application number: DE69227380T
Authority: DE
Inventors: Colin Louis Clifton Hill MASTERS; Ashley Ian Boston BUSH; Konrad Traugott Beyreuther
Original assignee: Prana Biotechnology Ltd
Current assignee: Alterity Therapeutics Ltd
Priority date: 1991-11-12
Filing date: 1992-11-12
Publication date: 2007-01-11
Anticipated expiration: 2012-11-13
Also published as: US20040265847A1; EP0613560A4; AU2926392A; AU669493B2; CA2123211A1; JP3277211B2; EP0613560B2; US5705401A; CA2123211C; DE69227380T2; JPH07503316A; EP0613560B1; WO1993010459A1; DE69227380D1; EP0613560A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit bei einem Menschen durch Regulieren der Wechselwirkung eines zweiwertigen Kations mit APP sowie ein Verfahren zum Testen neurologischer Funktionen unter Verwendung einer Zinkzubereitung.
Alzheimer-Krankheit ist eine progressive Demenz, die durch Amyloidablagerung in den intrazellulären und extrazellulären Räumen der Großhirnrinde gekennzeichnet ist (Davies et al., 1988). Die extrazellulären Ablagerungen bestehen aus einem Protein einer relativen Molekülmasse von 4000 (M_r = 4K), das als βA4 bezeichnet wird (Kang et al., 1987). Molekülklonierungs- und Proteinsequenzierungsstudien haben gezeigt, daß βA4 einen Teil der membranumfassenden und extrazelluläre Domänen des Amyloidvorläuferproteins (APP), welches Merkmale eines integralen Transmembranzellenoberflächenrezeptors aufweist (King et al., 1987; Goldgaber et al., 1987), umfaßt.
βA4 scheint das Ergebnis einer anomalen APP-Spaltung zu sein. Eine normale Spaltung erfolgt an oder nahe einem Lysinrest innerhalb der βA4-Sequenz (Esch et al., 1990; Sisodia et al., 1990; Palmert et al., 1989). Eine Spaltung an dieser Stelle dürfte die Bildung des amyloidogenen βA4-Fragments verhindern. Das normalerweise APP von der Membranoberfläche abspaltende Enzym wird als "APP-Sekretase" bezeichnet, obwohl es bislang noch nicht identifiziert ist.
Es hat sich gezeigt, daß mindestens eine APP-Form neurotrophe Aktivität, d.h. die Fähigkeit zur Förderung des Überlebens oder desn Auswuchses von Nervenfortsätzen besitzt. Eine Störung bei der APP-Verarbeitung kann für einen bei Alzheimer-Krankheit feststellbaren Verlust bestimmter Neuronenpopulationen verantwortlich sein.
Es gibt nun zunehmend Belege dafür, daß APP aus Membranen als Teil seiner normalen neurotrophen Funktion durch Spaltung an einer Stelle innerhalb der βA4-Sequenz (Lysin 16) durch APP-Sekretase freigesetzt wird. Da βA4 bei Alzheimer-Krankheit entsteht, deutet dies darauf hin, daß ein Ausfalls der Spaltung an dieser Stelle die Ursache für Alzheimer-Krankheit sein oder zumindest zum Fortschreiten der Krankheit beitragen könnte.
Es besteht ein Bedarf nach einem Test, der einen Voraussage- und Diagnosewert bei der Überwachung von Alzheimer-Krankheit und für irgendwelche einschlägige therapeutische Interventionen besitzt. Voruntersuchungen haben nahegelegt, daß die Werte von zirkulierendem APP bei Alzheimer-Patienten im Vergleich zu Normalen unterschiedlich sein können (Bush et al., 1991, WO-A-9116628) und daß solche Änderungen das Ergebnis einer geänderten APP-Verarbeitung sein können. Erfindungsgemäß hat es sich nun gezeigt, daß die Verarbeitung von zirkulierendem APP bei Alzheimer-Krankheit geändert ist und somit die Basis für einen Test auf diese Krankheit liefert. Weiterhin hat sich aus den Arbeiten, die zum erfindungsgemäßen Test führten, eine verbesserte Möglichkeit zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit durch Regulieren der Wechselwirkung zwischen zweiwertigen Kationen und APP ergeben.
Die vorliegende Erfindung ist mit der Bereitstellung eines Verfahrens zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit bei einem einer solchen Behandlung bedürfenden Patienten durch Einwir kenlassen von Mitteln zur Regulierung der Zinkwechselwirkung mit APP auf den Patienten befaßt. Dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung basiert teilweise auf der Erkenntnis, daß durch Regulieren der Wechselwirkung zwischen Zink und APP eine proteasevermittelte Verdauung von APP (d.h. APPase-Aktivität) geändert wird.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit die Verwendung eines Zinkbindemittels oder eines Mittels mit der Fähigkeit zur Blockade einer oder mehrerer Komponente(n) eines Zinktransportsystems zur Verminderung der Zinkaufnahme oder eines die biologische Verfügbarkeit von Zink vermindernden Mittels oder eines Mittels mit der Fähigkeit zur Unterdrückung einer Zinkabsorption, zur Förderung einer Zinkeliminierung oder zur Blockade der Kationenbindungsstelle auf APP oder auf dem für Kationen empfänglichen Promotorbereich des APP-Gens bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit, wobei das Medikament so formuliert ist, daß es zur oralen Verabreichung geeignet ist.
Bei Alzheimer-Krankheit erfolgt eine Erhöhung der APP-Spiegel. Erhöhungen von APP-mRNA treten bekanntlich im Gehirn sporadischer Alzheimer-Krankheitsfälle auf und sind höchstwahrscheinlich das pathogenetische Ereignis bei der Amyloidgenese, die in gleicher Weise das Down-Syndrom begleitet. Eine Erhöhung der APP-Spiegel kann bei normalen und Alzheimer-Krankheit-Freiwilligen, bei Ratten und bei PC12-Kulturzellen durch extrazelluläre Zinkbelastung induziert werden. Hierin wird gezeigt, daß extrazelluläres Zink die APP-Expression reguliert. Dies liefert eine Grundlage für eine therapeutische Intervention auf der Basis einer Regulierung der Wechselwirkung zweiwertiger Kationen mit APP.
Durch Regulieren der Gehalte an zweiwertigen Kationen oder Heparin oder irgendeiner sonstigen Einheit, die eine Bindung mit den Heparinbindungsstellen auf APP (Reste 318-331 und rund um die Reste 98-105) oder irgendeiner sonstigen Bindungsstelle auf APP mit der Fähigkeit zur Bindung dieser Einheiten (z.B. weitere Zink- oder Heparinbindungsstellen auf APP) eingehen können, lassen sich der Bereich, die Art und/oder das Ausmaß der APP-Spaltung derart ändern, daß eine unrichtige Protease-vermittelte Verarbeitung von APP vermindert oder gehemmt werden kann. Unter "Regulieren" ist die Änderung der Verfügbarkeit zweiwertiger Kationen und dreiwertiger Kationen oder von Heparin oder irgendeiner sonstigen Einheit, die eine Bindung mit den Heparinbindungsstellen auf APP (Reste 318-331 oder rund um die Reste 98-105) oder irgendeiner sonstigen Bindungsstelle auf APP mit der Fähigkeit zur Bindung dieser Einheiten (z.B. weitere Zink- oder Heparinbindungsstellen auf APP) eingehen kann, zur Bindung an APP vor oder gleichzeitig mit einer APPase-vermittelten Spaltung zu verstehen. Es hat sich gezeigt, daß Zink (Zn²⁺) an einer spezifischen und sättigungsfähigen Bindungsstelle an APP gebunden wird. Die Zinkbindungsstelle auf APP wurde durch enzymatische Verdauung von an Zn²⁺-chelatisierende Sepharose gekuppeltem, gereinigtem APP695-Fusionsprotein identifiziert. Das synthetische Peptid repräsentiert etwa die Reste 181-200 von APP, liegt zwischen den cysteinreichen und negativ geladenen Domänen des Proteins und hat sich als spezifisch und sättigungsfähig zinkbindend erwiesen. Die enge Verwicklung zwischen APP und Zink ist ein starkes Indiz für eine Beteiligung von Zink an der APP-Verarbeitung. APP bindet Heparin (in einer zu FGF analogen Weise). Es hat sich gezeigt, daß Heparin APP gegen eine proteolytische Verdauung schützt. Dies ergab sich beispielsweise bei Verwendung des proteolytischen Enzyms Trypsin. Eine Heparinkonzentration von nur 100 nM führt zu einer deutlichen Verminderung der Geschwindigkeit und des Ausmaßes eines Gehirn-APP-Abbaus durch Trypsin. Das Gehirn enthält eine Reihe von heparin- oder heparinsulfathaltigen Proteinen und somit kann die Wechselwirkung von Heparin mit APP APP gegen einen proteoly tischen Abbau in vivo stabilisieren. Es hat sich ferner gezeigt, daß Zink die Kinetik einer Heparinbindung an APP beeinflußt und die APP-Affinität gegenüber Heparin um das 5- bis 10-fache steigern kann. Überraschenderweise gehen bei niedrigen Zinkkonzentrationen (über etwa 1 μm) die Schutzwirkungen von Heparin verloren. Diese Erkenntnis deutet darauf hin, daß von der Norm abweichende Zinkgehalte in vivo, im intrazellulären und/oder extrazellulären Gehirnmilieu, eine von der Norm abweichende APP-Proteolyseverarbeitung fördern können und somit der Anlaß für das Amyloidprotein und somit eine folgende Alzheimer-Krankheit oder sonstige mit einer Amyloidablagerung im Gehirn vergesellschaftete Störungen sind.
Die die Schutzwirkungen von Heparin beseitigenden Mechanismen hinter Zink sind unbekannt.
Bei Alzheimer-Patienten durchgeführte Untersuchungen belegen, daß eine Verabreichung von Zink (z.B. von elementarem Zink in Form von Sulfat) bei einer mäßigen oralen Dosierung von 50–100 mg von Gramm pro Tag über einige Tage hinweg (unter Verwendung üblicher aus Apotheken erhältlicher Zinkergänzungsmittel) zu einer raschen Beeinträchtigung neuronaler Funktionen führt. Dies ergibt sich aus einem drastischen Verlust der Erkenntnisfunktionen bei Minimentalstatusprüfung (Folstein et al., 1975). Die Bewertung verschlechtert sich von schwacher Demenz bis zu einer nicht feststellbaren Funktion. Über den Zeitraum der Ergänzung verschlechterten sich auch Augenbewegungsanomalitäten und die allgemeinen Fähigkeiten, sich um sich selbst zu kümmern. Im Gegensatz dazu zeigten gesunde Freiwillige keine Krankheitswirkungen aufgrund einer Zinkergänzung.
Die mit Alzheimer-Patienten erzielten Ergebnisse stimmen mit einer neurotoxischen Reaktion auf einen Zinkstoffwechsel im Gehirn bei Alzheimer-Krankheit überein.
Gemäß einer Aspekt dieser Erfindung werden Alzheimer-Krankheit und sonstige neurologische Störungen durch Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines Zinkbindemittels mit der Fähigkeit zur Bindung eines zwei- oder dreiwertigen Kations und (dadurch bedingte) Regulierung seiner Wechselwirkung mit APP an einen einer solchen Behandlung bedürfenden Patienten behandelt, gelindert und/oder verhindert. Genauer gesagt, handelt es sich bei dem Kation um ein zweiwertiges Kation, insbesondere Zink, wobei es sich dann bei dem Bindemittel um ein Zinkbindemittel handelt. Diese Regulierung kann eine Verminderung der biologischen Verfügbarkeit von Zink infolge Komplexbildung mit Zink unter Verminderung der Menge an freiem Zink umfassen. Die Zinkbindung kann beispielsweise im Gastrointestinaltrakt, im Blutstrom und/oder im Gehirn, z.B. auf extrazellulärer und/oder intrazellulärer Ebene, erfolgen.
Erfindungsgemäß kann jedes pharmazeutisch akzeptable Zinkbindemittel verwendet werden. Besonders bevorzugt sind Bindemittel mit der Fähigkeit zum Durchdringen der Blut/Hirn-Schranke und somit zur Regulierung der Konzentrationen von freiem Zink im Gehirn auf extrazellulärer und/oder intrazellulärer Ebene, um von der Norm abweichende Zinkspiegel im Gehirn wieder herzustellen und somit einen Schutz gegen eine anomale APP-Verarbeitung, die für das Amyloidprotein verantwortlich sein kann, zu bieten. Beispiele für Zinkbindemittel (z.B. chemische Chelatbildner) sind Phytinsäure und deren Derivate, z.B. Phytat, Natriumcitrat und zinkspezifische Chelatbildner auf der Basis heterocyclischer Pyridone, wie 1,2-Diethyl-3-hydroxypyridin-4-on (CP94) und 1-Hydroxyethyl-3- hydroxy-2-methylpyridin-4-on (CP40) (Hilder et al., 1990). Diese Mittel können Zellmembranen durchdringen (CP94) oder zum Eindringen in die Zellen unfähig sein (CP40).
Eine Zinkwechselwirkung mit APP kann durch die Nahrung, durch Verabreichen einer Diät mit niedrigem Zinkanteil an Patienten oder durch Entfernen von Zinknahrungsquellen reguliert werden. Zink ist ist zahlreichen Nahrungsmitteln angereichert. Besonders stark ist dies bei Austern, Krabben, Rindfleisch, Leber und sonstigen Meerestier- und tierischen Produkten (Stanton, 1992). Die biologische Verfügbarkeit von Zink wird durch unbehandelte Weizenkleie, hohen Alkoholgenuß und verschiedene Proteine gehemmt. Die Vermeidung tierischer Produkte in Kombination mit einer unbehandelte Fasern, z.B. Weizenkleie, enthaltenden Diät kann die biologische Verfügbarkeit von Zink verringern und folglich den Beitrag von Zink zu einer Neurotoxizität reduzieren. Entsprechend diesem Aspekt wird somit ein Verfahren zum Behandeln/Lindern oder Verhindern von Alzheimer-Krankheit durch Verabreichung einer Diät niedrigen Gehalts an freiem Zink an ein einer solchen Behandlung bedürfendes Individuum geschaffen.
Der Ausdruck "Regulieren" erstreckt sich auch auf den Einsatz von Arzneimitteln, die Zinktransportmechanismen durch die Zellmembranen unterbrechen. Wie andere Metallionen, z.B. Eisen und Calcium, wird (auch) Zink über ein Zinktransportsystem (derzeit schlecht charakterisiert) in Zellen transportiert. An diesem System ist (sind) ein oder mehrere Protein(e) und/oder Lipid(e) und/oder Kohlenhydrat(e), das (die) den Zinkstrom durch die Membranen steuert (steuern), beteiligt. Arzneimittel, die eine oder mehrere Komponente(n) des Zinktransportsystems herausbrechen, können zur Blockade der Zinkaufnahme aus dem Darm sowie des Zinktransports in die und aus den Zellen im Gehirn verwendet werden. Gemäß diesem Aspekt wird folglich ein Verfahren zur Regulierung der Zinkwechselwirkung mit APP durch Verabreichung eines Arzneimittels mit der Fähigkeit zur Blockade einer oder mehrerer Komponente(n) des Zinktransportsystems mit dem Ziel einer Reduzierung der Zinkaufnahme an ein Individuum geschaffen. Unter Verwendung solcher Mittel läßt sich möglicherweise die Fehlverteilung von Zink in extrazellulären und intrazellulären Kammern bei Alzheimer-Krankheit korrigieren. Der Ausdruck "Regulieren" erstreckt sich ferner auf Maßnahmen zur Beeinflussung der Einwirkung der Kationen auf APP. Solche Maßnahmen umfassen beispielsweise Änderungen im pH-Wert. "Regulieren" bedeutet auch eine Änderung des Zinkstoffwechsels mit Mitteln, z.B. einer Eisenergänzung, die beispielsweise eine Zinkabsorption aus dem Darm unterdrücken und eine Zinkeliminierung fördern, oder durch Blockade der Kationenbindungsstelle auf APP oder auf dem auf Kationen ansprechenden Promotorbereich des APP-Gens beispielsweise mit Kupfer(II)ionen.
Eine Verabreichung von Zinkbindungsverbindungen und pharmakologischen Mitteln mit der F„higkeit zum Unterbrechen des Zinktransportsystems erfolgt oral.
Hohe Dauerkonzentrationen an extrazellulärem Zink (über 200 μM) sind bekanntlich neurotoxisch. Die Zinkkonzentrationen in den Hippocampus-Synapsen erreichen während der synaptischen Transmission kurzzeitig 300 μM. Die Unterbrechung des extrazellulären Zinkstoffwechsels kann eine wichtige Stufe im neurotoxischen Mechanismus, der eine Amyloidablagerung bei Alzheimer-Krankheit begleitet, sein. Die hierin beschriebenen Erkenntnisse stützen die Ansicht, daß APP eine wichtige Rolle bei der Regulierung bei der neuronalen Zinkkompartimentaufteilung spielt. Eine Anomalität des APP-Stoffwechsels kann folglich die Ursache für einen anomalen Zinkstoffwechsel sein. Eine Strategie zur Heilung dieser Anomalität bei Alzheimer-Krankheit dürfte die Wiederherstellung des normalen APP-Stoffwechsels beispielsweise durch Umkehrung der bei Alzheimer-Krankheit auftretenden anomalen APP-Proteaseresistenz oder durch Behandeln des Alzheimer-Patienten mit normalem APP-Ergänzungsmitteln umfassen.
Selbstverständlich sind die auf eine Regulierung der Zinkspiegel abzielenden Aspekte dieser Erfindung zu den bislang vorgeschlagenen Therapien, die vermuteten, daß Alzheimer-Krankheit mit einem Zinkmangel einhergeht, und folglich eine Zinkverabreichung an Alzheimer-Patienten vorgeschlagen haben, gegenläufig. Wie hierin beschrieben, hat es sich gezeigt, daß eine Verabreichung von Zink an Alzheimer-Patienten die Krankheit verschlechtert. Dies wurde aufgrund von neurologischen Standardtests ermittelt.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß Alzheimer-Krankheit durch Verabreichen einer Zinkprovokation an ein Individuum und anschließendes Testen der neurologischen Funktionen nach einem oder mehreren der bekannten Standardtests nachgewiesen werden kann. Im Vergleich zu normalen, Nicht-Alzheimer-Kontrollpersonen zeigt (hierbei) eine an Alzheimer-Krankheit leidende Person einen Abfall an Erkenntnisfähigkeit sowie auch eine Verschlechterung bei anderen neurologischen Standardfunktionstests. Ein üblicher Test ist das Testen der Augenbewegung auf visuelle Reize, die bei Alzheimer-Patienten im Vergleich zu normalen Kontrollpersonen bei Zinkprovokation deutlich vermindert ist. Die Menge an bei einem Provokationstest an ein Individuum verabreichtem Zink beträgt im allgemeinen 50–500 mg oder mehr. Die genaue, bei einem Test verabreichte Zinkmenge ist nicht entscheidend, sie basiert im allgemeinen (lediglich) darauf, daß die Nebenwirkungen auf eine Zinkverabreichung bei Alzheimer-Patienten auf ein Mindestmaß gesenkt werden.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einem weiteren Aspekt die Verwendung von Zink in der Formulierung eines Diagnostikums zur Gewinnung von Information betreffend die neurologische Funktion und folglich zur Bestimmung des Vorliegens oder Nichtvorliegens von Alzheimer-Krankheit bei einem Patienten.
Ein Verfahren zum Nachweis von Alzheimer-Krankheit gemäß diesem Aspekt kann in der Verabreichung einer Zinkprovokation an ein Individuum und anschließendem Testen der neurologischen Funktion bestehen. Hierbei ist eine Verschlechterung bzw. ein Abfall in der neurologischen Funktion im Vergleich zu normalen Kontrollpersonen ein Anzeichen für Alzheimer-Krankheit.
Die Zinkprovokation kann an einen Patienten auf verschiedene Art und Weise, z.B. oral, intravenös, intramuskulär, transdermal, rektal, intranasal u.dgl., verabreicht werden. Die orale Verabreichung wird bevorzugt. Wie bereits erwähnt, ist die bei einem Provokationstest an einen Patienten verabreichte Zinkmenge nicht kritisch, solange die verabreichte Menge zur Hervorrufung einer Antwort bei Alzheimer-Patienten ohne begleitende schwere Krankheitssymptome fähig ist.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden, nicht beschränkenden Figuren und Beispiele näher erläutert.
In den Figuren sind:
1 eine photographische Darstellung von Immunoblots zum Vergleich von Alzheimer-Krankheit- und altersangepaßtem Kontrollplasma-APP. Plasma-Heparin-Sepharose-Eluate (65 μg) wurden durch 8,5% (g/v) SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert und mit MAb 22C11, der ein aminoterminales Epitop erkennt, einem Imunoblotting unterworfen (vgl. Beispiel 1). Die relative Molekülmasse von Standardproteinmarkern (Rainbow Standards, Amersham, UK) ist auf der linken Seite dargestellt. APP-immunoreaktive Banden mit 130, 110 (ein Dublett), 65 und 42 kDa sind durch Pfeile auf der rechten Seite angegeben. Lediglich die relativen Häufigkeiten der 130- und 42-kDa-APP-Formen (wie in der veranschaulichten Probe) vermögen sichtbar zwischen Alzheimer-Krankheit im Vergleich mit (1A) nicht-dementen älteren Kontrollpersonen und (1B) normalen jungen Kontrollpopulationen zu unterscheiden.
2 eine photographische Darstellung eines Vergleichs der APP-proteolytischen Aktivität von Alzheimer-Krankheit-(B) und Kontroll-Plasma (A). Heparin-Sepharose-gereinigtes APP aus dem Plasma von Alzheimer-Patienten und Kontrollfällen wurde in Gegenwart bzw. Abwesenheit von 20 μM Zn²⁺ 2 h bei 37°C in Kochsalzpuffer inkubiert. Proben (65 μg Protein) einer jeden Inkubation wurden durch Elektrophorese auf 8,5% (g/v) Polyacrylamidgelen analysiert und mit 22C11 immunoblottiert. Die relative Molekülmasse von Standardproteinmarkern (Rainbow Standards, Amersham, UK) ist auf der linken Seite angegeben. Immunreaktive APP-Banden mit 130, 110, 65 und 42 kDa sind auf der rechten Seite durch Pfeile bezeichnet. Die Figur zeigt Proben von sechs Alzheimer-Krankheitsfällen und sechs normalen jungen erwachsenen Kontrollpersonen.
3 eine photographische Darstellung eines Western-Blots von Plättchen und Plasma bei Grauplättchensyndrom im Vergleich zu einer Kontrolle. Ein aliquoter Teil von 65 μg von durch Heparin-Sepharosechromatographie gereinigtem Plasma und 50 μg gewaschene Vollplättchen von einem Patienten mit Grauplättchensyndromen (GPS) wurden mit ähnlichen von einer jungen erwachsenen Kontrollperson erhaltenen Präparaten ver glichen. Die Proben wurden durch 10% (g/v) Polyacrylamidminigelelektrophorese analysiert und mit 22C11 immunoblottiert. Die relative Molekülmasse von Standardproteinmarkern (Rainbow Standards, Amersham, UK) ist auf der linken Seite angegeben. Die Lagen der immunreaktiven Hauptbanden bei normalen Plättchen (130 und 110 kDa) und eine kleinere Bande (65 kDa) sind auf der rechten Seite durch Pfeile gekennzeichnet.
4 eine graphische Darstellung einer zeitlichen Verlaufsanalyse einer ⁶⁵Zn-Bindung an Humangehirn-130/110-kDa-APP. Der Amyloidproteinvorläufer (APP) wurde nach der Methode gemäß Moir et al. (1992) gereinigt. Das Präparat von gereinigter 130- und 110-kDa-APP stammte aus Humangehirnmembranextrakten und enthielt den vollständige Länge aufweisenden Vorläufer mit intaktem Carboxylterminus jedoch ohne das 17-Rest-Signalpeptid. Die 130- und 110-kDa-Proteine erschienen bei der Silberfärbung nach einer Polyacrylamidgelelektrophorese in gleichen Verhältnissen und waren die einzig sichtbaren Banden. Die Identität dieser beiden Proteine wurde durch Westernblots mit monoklonalem Antikörper 22C11 (der ein aminoterminales Epitop auf APP erkennt) und durch Aminoterminussequenzierung bestätigt. Die Proteinkonzentration des APP-Präparats wurde durch Aminosäureanalyse bestimmt. Aliquote Teile von APP (90 ng, ≈1,1 pmol, unter der Annahme, daß das durchschnittliche Aminosäureformelgewicht von APP ≈80 kDa ist) wurden während der angegebenen Zeiträume bei 20°C inkubiert. Die Inkubationen (50 μl) erfolgten in 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, bei einem pH-Wert von 7,4 und in Anwesenheit von 10⁶ cpm ⁶⁵Zn (175 nM). Danach wurde die Inkubationslösung auf eine ein Bettvolumen von 1,1 ml aufweisende Sephadex-G25 (Pharmacia, Uppsala, Schweden)-Säule, die vorher mit 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH-Wert: 7,4, ins Gleichgewicht gesetzt worden war, aufgegeben, absetzen gelassen und anschließend mit 645 μl des Gleichgewichtspuf fers ausgesalzt. Eine vorhergehende Analyse der Aussalzungseigenschaften der Säule mit Mischungen aus Dextranblau und Kaliumdichromatlösung zeigte, daß mehr als 95% des Proteins im Inkubationsgemisch in diesem Volumen ohne nachweisbares vorhandenes freies Salz ausgesalzt wurden. Das ausgesalzte Protein wurde direkt in Zählröhrchen mit 10 ml einer wäßrigen Zählszintillationsmittellösung gesammelt. Zum vollständigen Aussalzen waren weniger als 2 min erforderlich. Die Menge des an das ausgesalzte APP gebundenen ⁶⁵Zn wurde durch Zählen der gesammelten Probe in einem auf den breitesten Kanal eingestellten Beta-Zähler bestimmt. Es wurde eine 51%ige Zählwirksamkeit ermittelt. Die angegebenen Werte stellen Mittelwerte ± Standardabweichung von n ≥ 3 Ablesungen dar. Diese Daten belegen, daß eine rasche Bindung von Zn an APP erfolgt (ungefähr 30% von Bmax nach 5 min) und nach 30 min ein Maximum erreicht.
5 eine graphische Darstellung einer Konkurrenzanalyse einer ⁶⁵Zn-Bindung an Humangehirn-130/110 kDa-APP. Aliquote Teile APP wurden – wie in 4 – 30 min mit ⁶⁵Zn inkubiert. Die Bindung des markierten Zn²⁺ an APP wurde in Konkurrenz mit unmarkiertem Zn²⁺ in Form des Chloridsalzes durchgeführt. Die angegebenen Daten zeigen die bei pH-Werten von 6,4 bzw. 7,4 gewonnenen Konkurrenzkurven. Die Bindung von Zn²⁺ an APP verschlechterte sich bei dem niedrigeren pH-Wert (ungefähr 45% von Bmax, pH-Wert: 7,4). Die Werte stellen Mittelwerte ± SEM von n ≥ 3 Ablesungen dar. Die dargestellten Kurven sind typisch für drei Experimente.
6 eine graphische Darstellung einer Scatchard-Analyse einer ⁶⁵Zn-Bindung an Humangehirn-130/110 kDA-APP. Aus den Ergebnispunkten in 5 ergibt die Scatchard-Analyse, daß die Dissoziationskonstante (K_D) für die Zn²⁺-Bindungsstelle auf APP bei einem pH-Wert von 7,4 764 nM und bei einem pH- Wert von 6,4 2,08 μM beträgt. Ein APP-Molekül bindet ein Zinkion.
7 eine graphische Analyse zur Veranschaulichung einer Spezifitätsuntersuchung der Zn²⁺-Bindungsstelle auf APP.

(a) Die APP-Inkubation mit ⁶⁵Zn und konkurrierendem nicht-markierten Zn²⁺ wurden unter den im Zusammenhang mit 5 detailliert beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Darüber hinaus ist die Konkurrenzwirkung durch Ca²⁺ und Mg²⁺ bezüglich einer Zn²⁺-Bindung dargestellt. Die Werte stellen Mittelwerte ± SEM von n ≥ 3 Ablesungen dar. Die Konkurrenzkurven für Ca²⁺ und Mg²⁺ sind mehr als zwei log-Einheiten nach rechts gegenüber der Zn²⁺-Konkurrenzkurve verschoben. Dies zeigt, daß die Bindungsstelle für Zn²⁺ bei physiologischen Konzentrationen spezifischer ist.
(b) Es wurde ein Vergleich bezüglich der Fähigkeit anderer Metallionen, mit ⁶⁵Zn um eine Bindung an APP zu konkurrieren, durchgeführt. Die APP-Inkubationen mit ⁶⁵Zn und konkurrierendem nicht-markierten Metallionen (mit 20 μM) wurden unter den im Zusammenhang mit 5 detailliert beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Die Werte stellen Mittelwerte ± SEM von n ≥ 3 Ablesungen dar. Zn²⁺ konnte bei 20 μM im Rahmen des Konkurrenzversuchs mehr als 97% der Markierung von APP verdrängen. Co²⁺ war bei der Konkurrenzbindung die nächstkommende Konkurrenz, es erreichte bei derselben Konzentration eine Verdrängung von ungefahr 70% der Markierung vom APP.

8 eine photographische Darstellung einer Analyse von immunreaktivem APP in Plasma durch Westernblot. Immunreaktive APP-Proteine in Heparin-Sepharoseeluaten aus Plasma wurden, durch 8,5%-SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Western-Blotting mit mAb 22C11 analysiert. Bahn 1: Heparin- Sepharoseeluat von Plasma (65 μg Protein); Bahn 2: durch Antiserum 90/3 (gegen Humangehirn-APP voller Länge entwickelt) immungefälltes Heparin-Sepharoseeluat; Bahn 3: Durch die Vorblutprobe von Antiserum 90/3 immungefälltes Heparin-Sepharoseeluat. Bahn 4: Durch Anti-Fd-APP (gegen APP-Fusionsprotein entwickelt) immungefälttes Heparin-Sepharoseeluat. Die relativen Molekülmassen von Standardproteinmarkern (Rainbow Standards, Amersham, UK) sind auf der linken Seite angegeben. Zuvor veröffentlichte¹⁵ immunreaktive Banden von APP mit 130, 110 (ein Dublett), 65 und 42 kDa sind durch Pfeile auf der rechten Seite gekennzeichnet.
9 eine graphische Darstellung von Streudiagrammen der Remissionsanalyse von Immunoblots zum Vergleich von AD mit Kontroll-Plasma-APP. Die Verteilung der Plasma-APP-Immunreaktivität wurde entsprechend den Einzelheiten in Tabelle 1 durch Remission analysiert. Die durchgezogenen Linien zeigen die Mittelwerte für jede Untergruppe. Zwischen AD und gepoolten Kontrollgruppen läßt sich ein signifikanter Unterschied in den Anteilen der 130- und 42-kDa-Arten von APP feststellen, Folglich wurde eine weitere Analyse bezüglich der Unterschiede in den Konzentrationen dieser Arten zwischen diesen Gruppen durchgeführt.

(a) Anteile von 130-kDa-APP in der AD-Gruppe und bei den einzelnen Kontrollgruppen. Der mittlere Anteil der 130-kDa-APP-Art reichte von etwa 50–80% (p ≤ 0,05; Scheffé, 1959), die er in der AD-Gruppe im Vergleich zu jeder Kontrollgruppe höher liegt. Die punktierte Linie deutet einen vermutlichen Schwellenwert für eine biochemische Charakterisierung von AD an, der eine Spezifität von 91% und eine Empfindlichkeit von 75% ergibt.
(b) Anteile der 42-kDa-APP-Konzentrationen in der AD-Gruppe im Vergleich zu den einzelnen Kontrollgruppen. Der mittlere Anteil der 42-kDa-APP-Art reichte etwa von 30–40% (p ≤ 0,05; Scheffé, 1959), die er in der AD-Gruppe im Vergleich zu den junge-Erwachsene- und den altermäßig entsprechenden Kontrollgruppen niedriger liegt. Die punktierte Linie deutet einen Schwellenwert für eine biochemische Charakterisierung von AD an, der eine Spezifität von 85% und eine Empfindlichkeit von 50% liefert.

Beispiel 1
Materialien und Methoden
Materialien:
Sämtliche Reagenzien mit Ausnahme des Tris-HCl waren analysenrein. Letzteres besaß Elektrophoresereinheit (BioRad) zur Vermeidung einer Verunreinigung mit Zinkspuren. ⁶⁵Zn wurde von Amersham (U.K.) erworben.
Fallauswahl:
Alzheimer-Krankheitsfälle erfüllten die NINCDS/Alzheimer-Krankheit-RDA-klinischen Kriterien (McKann et al., 1984) und wiesen eine Minimentalstatus (Folstein et al., 1975)-Bewertung von weniger als 17 auf. Jede altersmäßg entsprechende Kontrollperson unterzog sich einer Minimentalstatusprüfung und wurde ausgeschlossen, wenn die Bewertung unter 28 lag. Die unterschiedlichen neurologischen Diagnosen, die für die als nicht-dementen, mit neurologischen Krankheiten behafteten Kontrollpersonen dienten (n = 6), waren Epilepsie, Entmyelinisierung, Wasserkopf und drei Fälle von Gehirngefäßerkrankungen. Sämtliche Freiwilligen waren zum Zeitpunkt der Studien bei stabiler Gesundheit und litten an keiner akuten Krankheit.
Teilweise Reinigung von APP aus Plasma:
Hungernden Individuen wurde mit einer 21iger Nadel in heparinisierte Sammelröhrchen Blut (20–40 ml) entnommen. Das Blut wurde 15 min lang bei 2500 g zentrifugiert. Die überstehende Plasmafraktion wurde von dem Blutkörperchenpellet getrennt und 25 min bei 4°C und 19 000 g zentrifugiert (J2-21-Zentrifuge, Beckman, USA), um irgendwelche Bruchstücke zu entfernen.
Zum Nachweis von APP doch Western-Blotting wurde APP durch Heparin-Sepharosechromatographie teilweise von Plasma gereinigt. Plasma (2,5 ml) wurde auf eine zuvor bei 4°C mit Puffer 1 (175 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH-Wert: 7,4) ins Gleichgewicht gesetzten Heparin-Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Schweden)-Säule (8 mm × 5 mm) mit 0,25 ml Bettvolumen aufgegeben. Danach wurde die Säule mit 3,25 ml Puffer 1 gewaschen. Das APP wurde mit 750 μl Eluierpuffer (550 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH-Wert: 7,4) eluiert. Die Proteinkonzentration wurde nach der Methode von Smith et al. (1985) mit BCA unter Verwendung von Rinderserumalbuminstandards (Pierce, Rockford, IL, USA) bestimmt.
Gewaschene Plättchen wurden nach der Methode von Bush et al. (1990) hergestellt. Die Plättchen (1,2 × 10⁷) wurden in 30 μl Probenpuffer (100 mM Tris-HCl, 2% (g/v) Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,01% (g/v) Bromphenolblau, 5% (v/v) β-Mercaptoethanol (pH-Wert: 6,8) solubilisiert und vor dem Western-Blotting von Polyacrylamidgelen 10 min lang gekocht.
Plasmazinktest:
Nach der Methode von Davies et l1. (1968) wurden Zn²⁺-Tests mittels Atomabsorptionsspektrometrie durchgeführt.
Western-Blotting:
Western-Blottingmaßnahmen wurden entsprechend den Angaben von Bush et al. (1990) durchgeführt. Die Blots wurden mit einem monoklonalen Mausantikörper (mAb) 22C11 (Boehringer Mannheim, München, Deutschland), der ein Epitop auf dem Aminoterminus von APP (15) erkennt, bei einer Verdünnung von 1:60 000 in einem Blockierungspuffer sondiert bzw. unter sucht. Die Plasmaproben bei dieser Untersuchungsreihe wurden – sofern nicht anders angegeben – auf 8,5% (g/v) Polyacrylamidgelen getrennt. Unter diesen Bedingungen trennte sich die immunreaktive 110-kDa-APP-Bande in ein Dublett auf. Zum Zwecke der vorliegenden Analyse wurde jedoch die Summe der durch das Dublett erzeugten Signale als zu dem einen 110-kDa-Bereich gehörend angesehen.
Remissionsanalyse der Blots:
Eine Remissionsanalyse von Blots wurde durch Videoaufnahme mit einer Videk-Megaplus-Kamera (Kodak, Canandaigua, NY, USA), die mit Pixel Tools v1.1 (Perceptics, 1990) arbeitete, durchgeführt. Die Quantifizierung erfolgte anschließend mit der Software Image-v1.29-(W. Rasband, National Institutes of Health Research Services Branch, NIMH), welche genaue Ausrichtungen der einzelnen Blotbahnen mit dem Remissionsprofil und die Festlegung von Ausschlußgrenzen einzelner Peaks in den vier interessierenden Bereichen bei 130, 110, 65 und 42 kDa erleichterte. Die integrierte Remission (Fläche unter der Kurve) wurde auf diese Weise für jeden der vier Peaks bei jeder Probe berechnet. Die erhaltenen Werte waren für den jeweiligen Bereich über einen Bereich von Plasma-Heparin-Sepharose-Eluatdosen (20–90 μg Protein) linear zur Konzentration.
Zum Vergleich der relativen Mengen der vier APP-Derivate wurde in jeder Plasmaprobe der relativ Prozentanteil des Bandensignals am Gesamtbahnsignal ermittelt und danach der Durchschnittswert gebildet, wobei die in Tabelle 1 aufgeführten Werte erhalten wurden. Für die vier immunreaktiven Banden wurden mit einer Signifikanzzahl von p = 0,0125 (0,05 dividiert durch die Anzahl der Vergleichsproben) unabhängige Proben-Student-t-Tests zwischen gepoolten Kontrollgruppen und Alzheimer-Gruppen durchgeführt. Wenn sich diese Vergleiche signifikant unterschieden, wurden der Test einfacher Effekte (Weidemann et al., 1989) und anschließend post-hoc-Vergleiche nach Scheffé (1959) zwischen sämtlichen Paaren diagnostischer Gruppen (Alzheimer-Krankheit, Kontrollgruppe mit sonstigen neurologischen Krankheiten, normale junge erwachsene Kontrollpersonen und nicht-demente altersmäßig entsprechende Kontrollgruppe) durchgeführt.
Test auf APP-abbauende Protease:
Aliquote Teile (500 μl) von Eluaten aus jeder Heparin-Sepharose-Säule wurden unter Verwendung einer 1,7-ml-Sephadex-G25 (Pharmacia, Uppsala, Schweden)-Säule (8 mm × 34 mm), die mit 175 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, pH-Wert: 7,4, in Gegenwart oder Abwesenheit von 20 μM ZnCl₂ bei 4°C ins Gleichgewicht gesetzt worden war, ausgesalzt. Die Proteinkonzentration wurde mit dem gleichen Puffer auf 0,80 mg/ml eingestellt. Die Proben wurden danach 2 h bei 37°C inkubiert. Nach Entfernung aliquoter Teile (81,3 μl) wurde das Protein in jedem aliquoten Teil mit Choroform/Methanol (Wessel und Flugge, 1984) gefällt, in SDS-Probenpuffer gekocht und durch Western-Blotting unter Verwendung von MAb 22C11 analysiert.
Die Wirkungen von Inhibitoren verschiedener Proteaseklassen wurden durch Zusatz derselben zu diesen Inkubationsgemischen und Beobachten ihres Einflusses auf den Abbau von 130-kDa-APP getestet. Eine Probe (500 μl) eines Heparin-Sepharoseeluats aus dem Plasma einer normalen jungen erwachsenen Kontrollperson wurde in Zn²⁺-Puffer (175 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 20 μm ZnCl₂, pH-Wert: 7,4) ausgesalzt. Aliquote Teile (mit 65 μg Protein) wurden mit demselben Puffer mit einem Proteaseinhibitor auf 0,80 mg/ml verdünnt und dann 2 h lang bei 37°C inkubiert. Das Protein wurde in jeder Probe durch Zusatz von Chloroform/Methanol (wie oben) gefällt und dann immunoblottiert. Die Endkonzentrationen an Inhibitoren in den Inkubationsgemischen waren EDTA (1 mM), Diisopropylfluorphosphat (DFP) (1 mM), Aprotinin (10 μg/ml), N-Ethylmaleimid (NEM) (1 mM), Pepstatin A (10 μg/ml), α1-Antichymotrypsin (0,4 mg/ml) und Sojabohnentrypsininhibitor (SBTI) (1 mg/ml). In diesem System wurden auch die Wirkungen von Al₃Cl (20 μM) und Heparin (20 U/ml) gemessen.
Gehirn-APP-Präparat:
Amyloidproteinvorläufer (APP) wurde nach der Methode gemäß Moir et al. (1992) gereinigt. Die Präparate von gereinigtem 130- und 110-kDa-APP stammten aus Humangehirnmembranextrakten und enthielten das APP vollständiger Länge mit intaktem Carboxylende, jedoch ohne das 17-Rest-Signalpeptid. Die 130- und 110-kDa-Proteine lagen bei der Silberfärbung im Anschluß an eine Polyacrylamidgelelektrophorese offensichtlich in gleichem Verhältnis vor und waren die einzigen sichtbaren Banden. Die Identität dieser beiden Proteine wurde durch Western-Blots mit monoklonalem Antikörper (mAb) 22C11 (der ein aminoterminales Epitop auf APP erkennt [Weidemann et al., 1989]) und Aminoterminussequenzierung bestätigt. Die Proteinkonzentration der APP-Präparate wurde durch Aminosäureanalyse bestimmt.
Humanserumpräparat:
40–60 ml Vollblut wurden in blanken Röhrchen bei 20°C 3 h lang gerinnen gelassen. Das geronnene Blut wurde dann 16 h lang bei 4°C inkubiert und anschließend 15 min bei 1500 g zentrifugiert. Nach Entfernen des Überstands wurde das Serum weitere 15 min bei 1500 g zentrifugiert. Der zellfreie Überstand wurde entfernt.
⁶⁵Zn²⁺-Bindung an APP:
Die Bindungsanalyse wurde wie folgt durchgeführt: Aliquote Teile von APP (90 ng, ≈1,1 pmol, unter der Annahme, daß die durchschnittliche Aminosäureformelmasse von APP ≈80 kDa be trägt) wurden bei 20°C inkubiert. Die Inkubationen (50 μl) erfolgten in 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH-Wert: 7,4 in Gegenwart von 106 cpm ⁶⁵Zn (175 nM). Dann wurde die Inkubationslösung auf eine 1,1-ml-Bettvolumen-Sephadex G25 (Pharmacia, Uppsala, Schweden)-Säule, die zuvor mit 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH-Wert: 7,4, ins Gleichgewicht gesetzt worden war, appliziert, absetzen gelassen und dann mit 645 μl Gleichgewichtspuffer ausgesalzt. Eine Voranalyse der Aussalzeigenschaften der Säule mit Mischungen aus Rinderserumalbumin und Kaliumdichromatlösung zeigte, daß mehr als 95% des Proteins in dem Inkubationsgemisch in dieses Volumen ohne nachweisbares vorhandenes freies Salz ausgesalzt werden konnten. Das ausgesalzte Protein wurde direkt in Zählröhrchen mit 10 ml einer wäßrigen Zählszintillationsmittellösung (ACSII, Amersham) gesammelt. Zum vollständigen Aussalzen waren weniger als 2 min erforderlich. Die Menge von an das ausgesalzte APP gebundenem ⁶⁵Zn wurde durch Auszählen der gesammelten Probe in einem auf den breitesten Kanal eingestellten Beta-Zähler bestimmt. Die Zählung hat sich als 51% wirksam erwiesen. Die Bindung des markierten Zn²⁺ an APP wurde einer Konkurrenz(bindung) mit nichtmarkiertem Zn²⁺ und sonstigen Metallchloridsalzen unterworfen.
Charakterisierung der mutmaßlichen Zink-bindenden Domäne von APP:
16 μg des synthetisierten Peptids
GVEFVCCPLAEESDNVDSADAEEDDSDVWWGGAD, das den Resten 181-214 von APP₆₉₅ (oder den Resten 181-200) entspricht, oder 16 μg Kontrollpeptid wurden in 200 μl Blockadepuffer (50 mM Tris-HCl, 1 mM MnCl₂, 10 mM β-Mercaptoethanol, 20% Methanol, pH-Wert: 7,4) gelöst und punktförmig auf zuvor mit Methanol angefeuchtetes PVDF (Immobilon-P, Millipore, Befored, MA) aufgetragen. Der Fleck wurde dann 30 min lang bei 20°C mit 100 000 cpm ⁶⁵Zn²⁺ in Blockadepuffer in Gegenwart oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen von konkurrierendem nichtmarkiertem Zn²⁺ oder sonstigen zweiwertigen Kationen inkubiert. Nach der Inkubation wurde der punktförmig aufgetragene Fleck dreimal mit 200 μl Blockadepuffer ohne MnCl₂ gewaschen. Dann wurde der punktförmige Fleck ausgeschnitten, in 10 ml Szintillationsmittel gelegt und durch β-Zählung getestet.
Iodierung von APP:
100 kDa-Humangehirn-APP voller Länge wurden nach der Chloramin-T-Methode iodiert. Das iodierte APP (¹²⁵I-APP) wurde dann von den Markierungsreagenzien durch Sephacryl-G25-Chromatographie abgetrennt.
APP-Bindung an Heparin-Sepharose:
¹²⁵I-APP (0,37 pmol, 40 000 cpm) wurde in 250 μl Puffer 1 (50 mM Tris-HCl, 0,1% Rinderserumalbumin, pH-Wert: 7,4 ± 1 mM EDTA oder 25–150 μM ZnCl₂) auf eine Heparin-Sepharose-Säule (8 mm × 5 mm) mit 0,25 ml Bettvolumen, die zuvor bei 20°C mit Puffer 1 ins Gleichgewicht gesetzt worden war, aufgegeben. Die Säule wurde dann mit 6 ml Puffer 1 gewaschen und das APP mit aliquoten Teilen von Puffern hohen NaCl-Gehalts eluiert. Gradienteneluierungen erfolgten durch Eluieren in 50 mM-Inkrementen (700 μl) der NaCl-Konzentration von 0–1200 mM, gefolgt von einem Impuls von 2000 mM NaCl (in 50 mM Tris-HCl, 0,1% Rinderserumalbumin, pH-Wert: 7,4 ± 1 mM EDTA oder 50 μM ZnCl₂). Die Impulseluierung von an Heparin-Sepharose gebundenem APP benutzte 700 μl Puffer 2 (50 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 0,1% Rinderserumalbumin, pH-Wert: 7,4 ± 1 mM EDTA oder 25–150 μM ZnCl₂) und anschließend 700 μl Puffer 3 (100 mM CaCl, 50 mM Tris-HCl, 0,1% Rinderserumalbumin, pH-Wert: 7,4 ± 1 mM EDTA oder 25–150 μM ZnCl₂) und danach 700 μl Puffer 4 (500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 0,1% Rinderserumalbumin, pH-Wert: 7,4 ± 1 mM EDTA oder 50–150 μM ZnCl₂) und schließlich 2,5 ml Regenerierpuffer (2000 mM NaCl).
Eine APP-Bindung an Heparin-Sepharose wurde auch unter Verwendung von teilweise gereinigten APP-Präparaten aus Humangehirnmembranen (gemäß der Methode von Moir et al., 1992) oder Humanserum untersucht. Gewaschener Gehirnmembranextrakt oder Humanserum wurde auf eine MaCl-Konzentration von 350 mM eingestellt und auf eine Q-Sepharosesäule (5 cm × 5 cm) aufgegeben, mit 350 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH-Wert: 7,4 (250 ml [× 2 für den Gehirnmembranextrakt]) gewaschen und mit 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH-Wert: 7,4 (200 ml mit 5 ml/min) eluiert. Diese Maßnahme führt zu einer 80fachen Anreicherung von APP in den Peakproteinfraktionen. Diese wurden dann gepoolt (Moir et al., 1992). Das Eluat (20 ml) wurde in 25 mM Tris, pH-Wert: 7,4 (30 ml) mittels einer G26-Sephadex-Säule (2,6 cm × 40 cm) ausgesalzt. 15 ml des Produkts wurden mit 2 mM ZnCl₂, 50 mM Tris-HCl, pH-Wert: 7,4 auf 50 μM Zn²⁺ eingestellt. Die anderen 15 ml wurden mit 50 mM Tris-HCl, pH-Wert: 7,4 auf dasselbe Volumen eingestellt. 10 ml des ausgesalzten Q-Sepharose-Eluats mit 6,7 mg Protein wurden mit einer Geschwindigkeit von 0,35 ml/min auf Heparin-Sepharose (1,6 cm × 5 cm) appliziert, mit 100 ml Beladungspuffer gewaschen und mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,35 ml/min mit einem 0–1500 mM NaCl-Gradienten (±50 μM Zn²⁺) in 52,5 ml eluiert. Fraktionen (1 ml) entsprechend 20-mM-NaCl-Inkrementen wurden gesammelt. 30-μl-Proben einer jeden Fraktion wurden durch Western-Blotting mit mAb-22C11 nach der Methode gemäß Bush et al. (1990), die durch Verwendung von PVDF-Membranen und Verkürzen der Blockadedauer auf 1 h modifiziert worden war, auf APP getestet. Die auf den Blots festgestellte Immunreaktionsfärbung der 130-kDa-APP-Spezies wurde durch computerunterstützte Bilderfassungsreflexionsdensitometrie (Busch et al., 1992) quantifiziert. Die 130-kDa-Reflexionssignale auf den Blots wurden als Verhältnis des in einer Probenbahn entstandenen Signals zur 130-kDa-APP-Reflexions ablesung einer auf jedem einzelnen Filter als interner Standard vorhandenen Probe des Ausgangsmaterials ausgedrückt.
Beispiel 2
Anomales Profil von Plasma-APP bei Alzheimer-Krankheit:
Ein monoklonaler Antikörper (22C11), der den Aminoterminus von APP erkennt (Weidemann et al., 1989) identifizierte bei Western-Blots von Humanplasma (Bush et al., 1990; Buch et al., 1991) vier immunreaktive Hauptbanden von APP (130, 110, 65 und 42 kDa). Die relative Häufigkeit dieser Banden wurde bei Alzheimer-Patienten und Kontrollpersonen überwacht. Bei Alzheimer-Krankheitsfällen kam es im Vergleich zu Kontrollpersonen zu einem Anstieg der 130-kDa-Plasma-APP-Bande und einer Verminderung der 42-kDa-Plasma-APP-Bande. Die Kontrollpersonen bestanden aus Gruppen nicht-dementer, altersmäßig entsprechender Personen (1A), normaler junger Erwachsener (1B) und mit sonstigen neurologischen Krankheiten behafteter Patienten. Es gab keinen zusammenhängenden Unterschied in den Intensitäten der 110- und 65-kDa-Banden zwischen Alzheimer-Patienten und Kontrollpersonen. Die Gesamtmenge an APP-Immunreaktivität unterschied nicht zwischen Alzheimer-Patienten und Kontrollpersonen, da das Verhältnis Gesamtimmunreaktivität von Alzheimer-Patienten/Kontrollpersonen 1,02 ± 0,22 (Mittelwert ± Standardabweichung) betrug.
Eine Quantifizierung dieser Erkenntnisse durch Bilderfassungsanalyse (Tabelle 1) zeigte, daß die 130-kDa- und 42-kDa-Banden bei AD im Vergleich zu gepoolten Kontrollen (Durchschnittsdaten von mit anderen neurologischen Krankheiten behafteten Kontrollpersonen, normalen jungen erwachsenen Kontrollpersonen und nicht-dementen, altermäßig entsprechenden Kontrollpersonen) (zweiendig, p < 0,001) gestiegen bzw. gesunken waren. Bei Alzheimer-Krankheit war eine 60%ige Er höhung im Anteil der 130-kDa-Form und eine gleichzeitige 35%ige Senkung in der 42-kDa-Form feststellbar. Das Immunreaktivitätsmuster war bei der gepoolten Kontrollgruppe gleichmäßiger verteilt, wobei die am stärksten konzentrierte APP-Immunreaktivität im 42-kDa-Bereich lag. Dieser Trend blieb beim Vergleich von Alzheimer-Krankheitsfällen mit den drei Kontrolluntergruppen durchgängig erhalten. Hierbei bestätigt eine post hoc-Analyse die Signifikanz des Unterschieds zwischen der Alzheimer-Krankheit und jeder Kontrollgruppe im 130-kDa-Bereich und zwischen den Alzheimer-Patienten und jungen Erwachsenen und älteren Kontrollgruppen im 42-kDa-Bereich. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den mittleren Remissionsproportionen der drei Kontrollgruppen in sowohl den 130- als auch 42-kDa-Bereichen. Bei der altersmäßig emtsprechenden Kontrollgruppe waren im Vergleich zu der jungen erwachsenen Kontrollgruppe der 110-kDa-Bereich wesentlich höher und der 65-kDa-Bereich wesentlich geringer.
Identifizierung der 110-, 65- und 42-kDa-Plasma-APP-Banden als mögliche Spaltungsprodukte der 130-kDa-APP-Spezies:
Wurde Plasma-APP aus Heparin-Sepharoseeluaten 18 h bei 37°C inkubiert, wurde das APP langsam unter Verlust der 130-kDa-Bande und Betonung der drei geringeren Banden (110 kDa, 65 kDa und 42 kDa) langsam proteolytisch abgebaut. Die Proteolyse wurde durch die Anwesenheit von Zn²⁺ beschleunigt. Die zur Stimulierung der Proteolyse erforderliche Zinkkonzentration betrug 20 μm. Dieser Wert liegt innerhalb des Bereichs der normalen Humanplasmakonzentration (Davies et al., 1968). Die Geschwindigkeit der Zn²⁺-verstärkten Proteolyse war im Vergleich zu Kontrollproben von jungen Erwachsenen bei Alzheimer-Krankheit ähnlich. Bei beiden Gruppen fanden sich identische Abbauprodukte. Dies deutet darauf hin, daß die ein geringeres Molekulargewicht aufweisenden APP-Formen in Plasma Abbauprodukte der 130-kDa-Form sein könnten und daß eine Proteolyse der 130-kDa-Form in einem Alzheimer-Krankheitspräparat das Plasma-APP-Profil in Richtung desjenigen von Kontrollpersonen ändert.
Eine Zn²⁺-verstärkte APP-Proteolyse eines Kontrollpräparats eines jungen Erwachsenen über 2 h wurde sowohl durch EDTA, Heparin als auch die Serin-Proteaseinhibitoren Aprotinin, Diisopropylfluorphosphat und SBTI vollständig und durch α₁-ACT unvollständig gehemmt. Weder Al₃Cl, der Cystein-Proteaseinhibitor N-Ethylmaleimid noch der Säure-Proteaseinhibitor Pepstatin A beeinflußten die Reaktion.
Untersuchungen bezüglich der Herkunft von Plasma-APP-Formen:
Das durch Western-Blotting nachgewiesene APP-Signal wurde durch Ultrazentrifugieren von Plasma (100 000 g × 15 min) nicht beeinträchtigt. Durch MAb 22C11 auf Western-Blots von Heparin-Sepharose-Eluaten nachgewiesenes Plasma-APP konnte durch ein gegen das vollständige Länge aufweisende, native, von Gehirnmembran herrührende APP (90/3) gezüchtetes Kaninchenantiserum und auch durch ein gegen das Fusionsprotein APP₆₉₅ (Anti-Fd-APP) gezüchtetes Kaninchenantiserum immungefällt werden. Eine Immunofällung war jedoch mit dem Präimmunserum von 90/3 oder mit gegen synthetische Peptide entsprechend den carboxylterminalen 40 (anti-CT) oder 100 (Anti-A4CT) Resten von APP gezüchteten Kaninchenantiseren nicht möglich. Diese Ergebnisse belegen, daß die in Plasma beobachteten APP-Formen löslich sind und daß ihnen das Carboxylende fehlt.
Zur Bestimmung, ob APP in Vollplasma verarbeitet werden kann, wurde frisches Plasma einer jungen erwachsenen Kontrollperson über 8 Tage hinweg bei 37°C inkubiert. Das Plasma-APP wurde durch Heparin-Sepharosechromatographie getestet. Über diesen Zeitraum hinweg war kein signifikanter Abbau der 130-kDa-APP-Form feststellbar. Dies deutet darauf hin, daß im Plasma keine grundlegende Verarbeitung von APP erfolgt.
Es wurde bereits berichtet, daß es zwischen dem Gehalt an APP in Vollplättchen oder dem Elektrophoresemuster von Plättchen-APP auf Western-Blots bei Alzheimer-Patienten im Vergleich zu Kontrollpersonen keinen Unterschied gibt (Bush et al., 1990). Da bei Alzheimer-Krankheit andere Plättchen-abnormalitäten beschrieben wurden (Zubenko et al., 1987) und da ferner APP in dem Plättchen-α-Korn hoch angereichert ist (Bush et al., 1990; Bush et al., 1991, und Cole et al., 1990), wurde die Möglichkeit, daß eine Plättchen-APP-Freisetzung zum Plasma-APP-Spiegel einen Beitrag leistet, untersucht. Plättchen und Plasma eines Individiums mit Grauplättchensyndrom (GPS), einer angeborenen Anomalität, bei der die Gehalte im Plättchen-α-Korn stark vermindert sind, wurden untersucht. Die GPS-Plättchen enthielten weniger als 1% des bei normalen Plättchen vorkommenden APP (3). Im Gegensatz dazu war das durche Heparin-Sepharosechromatographie gereinigte 130-kDa-Plasma-APP bei GPS im Vergleich zur Kontrolle etwa 50% reduziert (3). Diese Daten belegen, daß es unwahrscheinlich ist, daß die in Plasma gefundenen APP-Arten ein durch eine Plättchenfreisetzung von APP während der Plasmaherstellung entstandenes Kunstprodukt sind, daß jedoch eine Plättchenzerstörung möglicherweise in der Milz einen Beitrag zur Plasma-APP leistet.
Beispiel 3
Studien der APP-Physiologie-Zinkmodulierung.
I) Einfluß einer Zinkbelastung auf Humanplasma-APP.
100 mg elementares Zink (als Sulfat, in Kapseln) wurden oral an zwei Individuen mit Alzheimer-Krankheit (NINCDS/ADRDC-Kriterien mit abnormalen Plasma-APP-Profilen) und zwei altersmäßig entsprechende Kontrollpersonen (mit normalen Plasma-APP-Profilen) verabreicht. Die Zugabe wurde 7 Tage lang fortgesetzt. Vor Beginn der Zinkergänzung und 3 Wochen nach dem Aufhören der Zinkergänzung wurde Morgenblut im nüchteren Zustand abgenommen. Western-Blots mit monoklonalem Antikörper 22C11 wurden in der zuvor geschilderten Weise mit 65 μg aus den Proben gereinigtem Plasma-Heparin-Sepharoseeluat durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten eine Erhöhung der 130-kDa-Spezies-Plasma-APP relativ zu den sonstigen vorhandene Spezies, mit anderen Worten gesagt, eine Verschiebung in Richtung des Profils der APP-Spezies, die für Alzheimer-Krankheit typisch ist. Die beiden Kontrollplasma-APP-Profile näherten sich Alzheimer-Krankheitsprofilen, die beiden Alzheimer-Profile verschlechterten sich. Die proportionale Zunahme der 130-kDa-Spezies betrug etwa 20% pro Tag Zinkergänzung. Ein älterer Kontrollfreiwilliger, der über 3 Tage hinweg eine viermal stärkere Dosis erhalten hatte, zeigte dieselben Änderungen in seinem Plasma-APP-Profil. Diese hielten noch 3 Tage nach Absetzen der Ergänzung an.
II) Einfluß einer Senkung der Plasmazinkkonzentrationen auf APP-Spiegel.
In der Stunde nach der Mahlzeit fallen bekanntlich die postprandialen Plasmazinkspiegel (um) etwa 10%. Sieben Alzheimer-Freiwillige und sechs altermäßig entsprechende Kontrollpersonen wurden sowohl in nüchterem Zustand als auch 1 h nach einem standardisierten Frühstück auf ihr Plasma-APP-Profil und ihre Zinkspiegel hin getestet. Sowohl die Spiegel von Plasmazink als auch von 130-kDa-APP sanken (um) etwa 10%. Es herrschte eine lineare Beziehung zwischen der Änderung im APP-Spiegel und der Änderung in der Zinkkonzentration.
Ein junger erwachsener Freiwilliger erhielt während einer Hungerphase eine orale Dosis von 50 g Glucose. Innerhalb der ersten halben Stunde nach der Glucosedosis fielen sowohl die Plasmazink- als auch die 130-, 110- und 65-kDa-APP-Spiegel (um) etwa 10%. Über eine Dauer von 4 h mit anfänglichem Abfall und anschließender Rückprallerhöhung der Plasmazinkkonzentration war eine enge Parallele bei der Plasma-APP-Konzentration feststellbar. Die Bestimmung erfolgte mittels eines APP-Radioimmuntests unter Verwendung eines gegen natives Gehirn-APP (90/3) gezüchteten Antikörpers.
III) Bestimmung der Plasmazinkkonzentrationen bei Alzheimer-Krankheit:
Im Vergleich zu altersmäßig entsprechenden Kontrollpersonen waren im Plasma von fastendem Alzheimer-Patienten die Plasmazinkspiegel nicht signifikant erhöht.
IV) Einfluß einer Zinkbelastung auf Rattenhirn-APP.
16 Wochen alte Sprauge-Dawley-Rattenböcke erhielten 4 Tage lang eine tägliche Injektion mit 120 mg/kg ZnCl₂-Lösung. Die Versuchstiere wurden anschließend betäubt und durch Herzinnenpunktion ausgeblutet. Nach Entfernen ihrer Gehirne wurden diese homogenisiert und nach dem Ultrazentrifugieren in Membran- und lösliche Fraktionen getrennt. Western-Blots von Heparin-Sepharoseeluaten von Plasma, Membranextrakten und löslichen Fraktionen zeigten die Entwicklung einer neuen 80-kDa-Bande im Plasma und eine ungefähr 80%ige Steigerung in den Mengen sämtlicher APP-Formen bei den Ratten, die eine Zinkergänzung erhalten hatten, im Vergleich zu Kontrollplasma und Gehirnpräparaten (aus Tieren des Wurfs, die kein Zink erhalten hatten).
V) Einfluß von extrazellulärem Zink auf gezüchtete PC12-Zellen.
24 h lang wurden in Anwesenheit von Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, N2), das mit 8% fötalem Kalbserum (FCS) ergänzt war, Plattenkulturen von 10⁶ PC12-Zellen angelegt. Danach wurde das Medium entfernt und durch DMEM ± 2 bis 50 μM ZnCl₂ oder ein anderes Salz, jedoch ohne FCS, ersetzt.
Zellen und Medien wurden 48 h später geerntet. Aliquote Teile Medien, Zellcytosol und Membran (nach einer Lyse und Ultrazentrifugieren) wurden mit mAb 22C11 durch Western-Blotting auf APP getestet. Die Ergebnisse von vier Versuchen mit Kontrollproben zeigten, daß das Zink eine merkliche Zunahme an in die Medien freigesetztem APP induzierte, und zwar ungefähr 50% bei 2 μM mit einem Anstieg auf einen Spitzenwert von ungefähr 200% bei 50 μM. FeCl₂ besaß eine ähnliche Wirkung, Kupfer(I)- und Aluminiumchlorid besaßen weit geringere stimulierende Wirkungen. Diese Änderungen waren von geringeren Steigerungen an Cytosol-APP begleitet. In den Membran-assoziierten APP-Spiegeln war keine Änderung feststellbar.
VI) Einfluß von extrazellulärem APP auf die Zinkaufnahme durch PC12-Zellen.
24 h lang wurden in Anwesenheit von Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, N2), das mit 8% fötalem Kalbserum (FCS) ergänzt war, Plattenkultuen von 10⁶ PC12-Zellen angelegt. Das Medium wurde danach entfernt, durch DMEM ohne FCS ersetzt und weitere 24 h lang inkubiert. Dann wurden die Zellen gewaschen (× 2 mit DMEM) und mit DMEM, das mit 10 nM gereinigtem, Gehirnmembran-assoziiertem APP mit 130/110 kDa mit 20 000 cpm ⁶⁵Zn (hergestellt wie im Zusammenhang mit 1 beschrieben) ergänzt war, inkubiert. Nach wechselnder Inkubationsdauer wurden die Zellen geerntet, gewaschen, einer Pronaseverdauung unterworfen, um Oberflächenproteine zu entfernen, danach in einem Szintillationsmittel lysiert und in einem Beta-Zähler getestet. Die Ergebnisse zeigten, daß in Gegenwart von APP innerhalb 1 h ungefähr 10% der Zählimpulse im Vergleich zu ungefähr 4% bei Abwesenheit von APP internalisiert wurden (zwei Versuche mit im Doppel durchgeführten Inkubationen). Diese Daten belegen, daß APP bei der zellulären Aufnahme von externem Zn²⁺ eine Rolle spielen könnte.
Beispiel 4
Bindung von Zink an APP
Zur Bestimmung, ob APP Zink bindet, wurden Inkubationen von Humangehirn-APP voller Länge mit ⁶⁵Zn²⁺ und konkurrierenden Konzentrationen von nichtmarkiertem Zn²⁺ durehgeführt. Eine maximale Bindung wurde nach 15 min beobachtet (30% B_max nach 1 min). Diese war mit einer Dissoziationskonstante (K_D) von 764 nM bei einem pH-Wert von 7,4 und von 2,08 μM bei einem pH-Wert von 6,4 sättigbar. Die Bindung von ⁶⁵Zn²⁺ an APP war für sämtliche konkurrierenden Metallionen einschließlich Ca²⁺ und Mg²⁺ spezifisch. Co²⁺ war das am stärksten konkurrierende Kation. Es besaß die Fähigkeit zu einer 70%igen B_max-Konkurrenz bei 20 μM. Schwermetalle, Cu²⁺ und Al³⁺ konkurrierten bei 20 μM um etwa 60% B_max. Die Stöchiometrie der Zn²⁺-Bindung bei APP betrug 1:1.
Eine mutmaßliche Zn²⁺-Bindungsstelle wurde durch Trypsinverdauung von APP und anschließende Aminoterminussequenzierung eines 6-kDa-Verdauungsfragments, das an mit Zn²⁺-beladene, chelatbildende Sepharose gebunden war, identifiziert. Die Fragmentsequenz war FRGVEFVXXPLA. Zur weiteren Charakterisierung und Bestätigung der Zn²⁺-Bindungseigenschaften dieses APP-Bereichs wurden synthetische Peptidkandidaten mittels der dot-blot-Methode untersucht. Ein synthetisches Peptid entsprechend den Resten 181-214 von APP besaß Fähigkeit, Zn²⁺ in sättigungsfähiger und spezifischer Weise zu binden. Die Rolle der Cysteinreste bezüglich eines Beitrags zur Fähigkeit dieses Peptids zur Bindung von ⁶⁵Zn²⁺ wurde durch Untersuchen der Fähigkeit desselben Peptids zur Bindung von ⁶⁵Zn²⁺ nach Modifizierung der Cysteine in dem Peptid durch Carboxyamidomethylierung und durch Untersuchen der ⁶⁵Zn²⁺-Bindung an ein anderes synthetisches Peptid entsprechend den Resten 189-220 von APP₆₉₅ ohne die Cysteinreste in den Stel lungen 186/187 bestimmt. Beide Peptide vermochten ⁶⁵Zn²⁺ signifikant über dem Rauschen, jedoch bis zu lediglich etwa 15% der ⁶⁵Zn²⁺-Bindungsmenge, die bei Verwendung derselben Menge des 181-214-Peptids (oder 181 bis 200) auftrat, zu binden. Dies deutet darauf hin, daß die Cysteinreste für die Zinkbindungseigenschaften dieses Peptids obligatorisch sind. Ähnliche Mengen an anderen Peptiden entsprechend anderen Bereichen des APP-Moleküls (Reste 422-433, 581-601, 645-655) und andere Kontrollpeptide (Renin und Insulin A-Kette) vermochten Zn²⁺ nicht zu binden. Die positive Kontrolle (Insulin B-Kette) band ⁶⁵Zn²⁺.
Zur Erforschung der funktionellen Signifikanz einer Zn²⁺-Bindung an APP wurde der Einfluß von Zn²⁺ auf eine Heparinbindung an APP aus drei Quellen, iodiertes gereinigtes Gehirn-APP, teilweise gereinigtes, unmarkiertes Humangehirn-APP und teilweise gereinigtes, unmarkiertes Humanserum-APP, untersucht. Die Menge des an Heparin bindenden Gehirn-APP wurde spezifisch durch die Anwesenheit von 50 μM Zn²⁺ (um) etwa 50% erhöht. Die Steigerung der ¹²⁵I-APP-Bindung an Heparin erreichte ein Plateau bei 75 μM Zn²⁺. Zn²⁺ erhöhte den Anteil der Bindung von APP an Heparin mit höherer Affinität und steigerte die Menge an ¹²⁵I-APP, die aus der 50–2000 mM-NaCl-Eluierfraktion gewonnen wurde, in Anwesenheit von 50 μM Zn²⁺ um das etwa 3fache und in Anwesenheit von 100 μM Zn²⁺ um das 4,5fache. Ca²⁺ und Mg²⁺ änderten das Profil der ¹²⁵I-APP-Eluierung nicht. Co²⁺ erhöhte bei 75 μM die Rückgewinnung des ¹²⁵I-APP in den 100-500- und 500-2000-mM-NaCl-Fraktionen. Al³⁺ senkte die Rückgewinnung von ¹²⁵I-APP ausgenommen in der 500-2000-mM-NaCl-Fraktion, in der die Rückgewinnung auf etwa das 4,5fache stieg. Zn²⁺ besaß bei 50 μM eine ähnliche Wirkung auf das NaCl-Gradienteneluierprofil von an Heparin-Sepharose gebundenem, teilweise gereinigtem Gehirn-APP. Das Vorhandensein von Zn²⁺ führte zu einer Zunahme der rückgewonnenen APP-Menge in sämtlichen Fraktionen von 1110 auf 1644 Remissionseinheiten, einer Zunahme von 48%, und ferner zu einer Erhöhung der APP-Rückgewinnung in durch NaCl-Konzentrationen von über 520 mM eluierten Fraktionen. Trotz der erhöhten APP-Rückgewinnung in den eluierten Fraktionen zeigte ein Proteintest eine 13%ige Verminderung der Menge an eluierten Protein. Dies deutet darauf hin, daß das Vorhandensein von Zn^2– die Spezifität der APP-Bindung an Heparin steigerte. Eine ¹²⁵I-APP-Rückgewinnung erfolgte über einen Bereich von NaCl-Konzentrationen, die 200–300 mM niedriger waren als bei der Eluierung von teilweise gereinigtem Gehirn-APP. Dies kann das Ergebnis einer radiolytischen oder oxidativen Schädigung des APP-Moleküls während der Iodierung sein. Die Möglichkeit, daß die Eluierung von teilweise gereinigtem APP durch mitgereinigtes Material beeinflußt wird, kann jedoch nicht ausgeschlossen werden.
Das Vorhandensein von 50 μM Zn²⁺ förderte eine geringere Steigerung der Bindung von teilweise gereinigtem Serum-APP an Heparin-Sepharose. In den Serumproben betrug die Zunahme an bei der NaCl-Eluierung rückgewonnenem APP etwa 10%. Ein Proteintest aus rückgewonnenen Fraktionen zeigte jedoch, daß anders als beim Einfluß von Zn²⁺ auf die Heparin-Sepharosechromatographie von teilweise gereinigten Gehirnproteinen der Einfluß von Zn²⁺ auf die Heparin-Sepharosechromatographie von teilweise gereinigtem Serum darin bestand, die rückgewonnene Proteinmenge um 12% zu erhöhen. Anders als sein Einfluß auf das Salzeluierprofil von aus dem Gehirn stammendem APP führte das Vorhandensein von Zn²⁺ bei der Heparin-Sepharosechromatographie von aus Serum stammendem APP nicht zu einer Steigerung des Anteils an Bindung mit höherer Affinität.
Die Wirkung von Zn²⁺ bei der Modulierung einer Heparinbindung an APP wurde auch im Rahmen eines Biosensorsystems untersucht. Bei 100 μM hat es sich gezeigt, daß Zn²⁺ in star kem Maße eine Heparinbindung an aus dem Rattengehirn gereinigtem APP fördert. Diese Wirkung war im Vergleich zum Fehlen zweiwertiger Kationen oder zur Anwesenheit von Ca²⁺, Mg²⁺ oder Co²⁺ am ausgeprägtesten und spezifischsten bei Zn²+. Am deutlichsten war sie bei niedrigem Verhältnis Heparin/AP. Konzentrationen von Zn²⁺ von nur 50 nM besaßen einen deutlichen Einfluß auf eine Steigerung der Heparinbindung an Rattengehirn-APP. Zn²⁺ förderte bei 50 mM eine etwa 170%ige Zunahme der Heparinbindung. Die Wirkung war bei 70 μM gesättigt.
Beispiel 5
Heparin schützt APP gegen eine proteolytische Spaltung Zink beseitigt die Schutzwirkung von Heparin
Die proteolytische Aktivität von Trypsin (Boehringer, Mannheim) wurde untersucht, um zu bestimmen, ob sie durch wechselnde Dosen von Heparin (Sigma) und ZnCl₂ verändert wird. Sowohl Heparin als auch ZnCl₂ veränderten die Trypsinaktivität nicht. Dies ergab sich aus einer Bestimmung der Fähigkeit zur Spaltung einer fluorogenen synthetischen Substanz Z-F-R-AMC. Dies belegt, daß Trypsin eine geeignete Serinprotease zur Verwendung im Rahmen von Untersuchungen hinsichtlich einer Änderung oder Modulierung der proteolytischen Widerstandsfähigkeit von APP durch Heparin und Zink ist. Mit Trypsin wurde in einem Mengenverhältnis von 1/64 (Enzym/Substrat) 1 h lang bei 37°C von Humangehirnmembran herrührendes APP (das den intakten Carboxylterminus enthält) verdaut. Western-Blots für APP unter Verwendung des APP-bindenden monoklonalen Antikörpers 22C11 dienten zur Überwachung des Fortschreitens der proteolytischen Reaktion und zum Nachweis von Abbauprodukten. Es hat sich gezeigt, daß die Anwesenheit von Heparin in Konzentrationen von nur 100 nM eine deutliche Verminderung in der Geschwindigkeit des Gehirn-APP-Abbaugrades durch Trypsin verursachte. Diese Schutzwirkung war bei 10 μM gesättigt.
Die Anwesenheit von Zn²⁺ (bis zu 100 μM) oder EDTA (1 mM) besaß bei dieser Reaktion keinen Einfluß auf die Geschwindigkeit der APP-Proteolyse durch Trypsin. Die Anwesenheit von Zn²⁺ (über 1 μM) zusammen mit Heparin (1 μM) bei der proteolytischen Reaktion beseitigte jedoch vollständig diese Schutzwirkung von Heparin. Dies war eine unerwartete Antwort, da vorherige Ergebnisse zeigten, daß die Anwesenheit von Zn²⁺ die Heparinbindung an APP fördert.
Eine mögliche Erklärung für diese Erkenntnis ist, daß die Zinkbindung an APP die Heparinbindung an einer anderen Stelle des Proteins, von der bekannt ist, daß sie in Richtung auf das Zentrum von APP liegt, durch Verstärken der Proteinkonformationsstabilität begünstigt. Die durch Zink verursachte Konformationsstabilisierung kann das Offenbleiben des Zentralbereichs von APP für ein Haftenbleiben von Heparin an den Resten 98 bis 105 von APP₆₉₅ (CKRGRKQCKTH) oder den Resten 318 bis 331 von APP₆₉₅ (KAKERLEAKHRER) – vielleicht aufgrund eines Ladungseffekts – begünstigen. Wenn eine Heparinbindung in Abwesenheit von Zink erfolgt, kann das Protein dazu gebracht werden, eine stärker kugelige und proteaseresistente Konformation anzunehmen. Diese Zinkbindung an APP könnte das APP so weit stabilisieren, daß eine Heparinbindung daran gehindert wird, eine den Proteasewiderstand steigernde APP-Konformationsänderung einzuleiten.
Beispiel 6
Verabreichung von Zink bei Alzheimer-Krankheit (AD)
Die Patienten aus Beispiel 3 wurden untersucht.
Die gesunden Freiwilligen litten an keinen Krankheitseffekten aufgrund der Zinkergänzung.
Die beiden Alzheimer-Freiwilligen fühlten sich unter Zinkergänzung akut unwohl. Beide litten an einem schweren Verlust an Erkenntnisfunktion bei der Minimentalstatusprüfung (Folstein et al., 1975). Die Bewertungen verschlechterten sich von mäßigen Demenzgradeb bis nicht feststellbarer Funktion. Die Augenbewegungsanomalitäten und die allgemeinen Fähigkeiten, für sich selbst sorgen zu können, verschlechterten sich über die Ergänzungsperiode. Diese Antwort stimmte mit einer neurotoxischen Reaktion auf die Zinkergänzung überein. Wurde die Zinkergänzung abgesetzt, kehrte die Erkenntnisfunktion innerhalb von 2 Wochen wieder auf das vorherige Niveau zurück.
Folglich kann ein Diagnosetest eine orale Zinkprovokation umfassen. Ein klinisch gemessene neurotoxische Reaktion wäre mit der Diagnose AD verträglich.
Die Wechselwirkung zwischen APP, Zink und Heparin ist derzeit noch nicht geklärt. Aus dieser Beschreibung geht jedoch hervor, daß sowohl Zink als auch Heparin über spezielle Bindungsstellen mit APP eine Wechselwirkung eingehen und dabei seine Proteolysestabilität ändern. Die Erfinder haben eine Zinkbindungsstelle und eine Heparinbindungsstelle auf APP identifiziert. Auf dem APP-Molekül können auch noch weitere dessen Stabilität ändernde Zink- und Heparinbindungsstellen vorhanden sein. Diese Erfindung erstreckt sich auf die Änderung bzw. Modulierung der Wechselwirkung von Zink und/oder Heparin und/oder sonstiger Mittel mit APP zur Behandlung, Linderung oder Verhinderung von Alzheimer-Krankheit und sonstigen neurologischen Störungen, die mit einer irrtümlichen APP-Verarbeitung einhergehen.
Für den Fachmann dürfte es selbstverständlich sein, daß die hierin beschriebene Erfindung über die spezielle Beschreibung hinaus verschiedenen Änderungen und Modifikationen zugänglich ist. Selbstverständlich fallen unter die Erfindung sämtliche derartigen Änderungen und Modifikationen. Die Er findung umfaßt ferner sämtliche Stufen, Merkmale, Zusammensetzungen und Verbindungen, auf die in dieser Beschreibung alleine oder kollektiv hingewiesen oder eingegangen wurde, sowie jegliche und sämtliche Kombinationen irgendwelcher zwei oder mehrerer dieser Stufen oder Merkmale.
TABELLE 1 Anteile der Plasma-APP-Formen, analysiert durch Bilderfassung bei Alzheimer-Krankheit und Kontrollpersonen.
Heparin-Sepharoseeluate von Alzheimer-Krankheit- und Kontrollplasmaproben wurden mit MAb 22C11 immunoblottiert. Die Remissionen der Banden bei 130, 110, 65 und 42 kDa wurden durch computergestützte Bilderfassungsanalyse (vgl. Beispiel 1) gemessen. Die relativen Mengen der vier APP-Derivate – Prozentanteile am Gesamtbahnnsignal – wurden in jeder Plasmaprobe bestimmt und auf die hierin präsentierten Werte gemittelt. Unabhängige Proben-t-Tests zwischen gepoolten Kontrollen und Alzheimer-Krankheitsgruppen wurden in den vier Bereichen mit einer Signifikanzzahl von 0,0125 durchgeführt. Die Vergleiche waren für lediglich zwei Bereiche, 130 und 42 kDa signifikant (zweiendig, p < 0,001). Vergleiche zwischen sämtlichen Paaren der Diagnosegruppen (Alzheimer-Krankheit, Kontrollpersonen mit sonstigen neurologischen Krankheiten, normale junge erwachsene Kontrollpersonen und nicht-demente altersmäßig entsprechende Kontrollpersonen) wurden anschließend für die 130- und 42-kDa-Banden (vgl. Beispiel 1) durchgeführt.
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WO-A-9116628

Claims

Verwendung eines Zinkbindemittels oder eines Mittels mit der Fähigkeit zur Blockade einer oder mehrerer Komponente(n) eines Zinktransportsystems zur Verminderung der Zinkaufnahme oder eines die biologische Verfügbarkeit von Zink vermindernden Mittels oder eines Mittels mit der Fähigkeit zur Unterdrückung einer Zinkabsorption, zur Förderung einer Zinkeliminierung oder zur Blockade der Kationenbindungsstelle auf APP oder auf dem Kationenansprechpromotorbereich des APP-Gens bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit, wobei das Medikament so formuliert ist, dass es zur oralen Verabreichung geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Zinkbindemittel um eine oder mehrere Verbindungen) von Phytinsäure und ihren Derivaten, Natriumcitrat, 1,2-Diethyl-3-hydroxypyridin-4-on und 1-Hydroxyethyl-3-hydroxy-2-methylpyridin-4-on handelt.
Verwendung von Zink bei der Zubereitung eines Diagnostikums zum Erhalt von Information betreffend die neurologische Funktion durch Verabreichen einer Zinkprovokation und anschließendes Testen der neurologischen Funktion und folglich Bestimmen des Vorliegens oder Fehlens von Alzheimer-Krankheit bei einem Patienten.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Diagnostikum in einer zur oralen, intravenösen, intramuskulären, transdermalen, rektalen und intranasalen Verabreichung geeigneten Form vorliegt.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Verabreichung oral erfolgt.