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Beschreibung zu der Patentanmeldung betreffend: "Prüfmittel und Verfahren
zu dessen Herstellung" Die Erfindung betrifft Prüfmittel zur Untersuchung von Flüssigkeitsproben,
ihre Herstellung und Anwendung.
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Sie betrifft besonders synthetische Reagentienträger, in denen ein
Reagens enthalten ist, zur Anwendung für qualitative und quantitative Bestimmungen
chemischer oder biochemischer Substanzen in Flüssigkeiten, besonders Körperflüssigkeiten.
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Prüfmittel zum Nachweis von BestandteSen biologischer Flüssigkeiten,
wie Blut und Urin,werden sehr weit verbreitet zur Unterstützung medizinischer Diagnosen
und Behandlungen angewandt. Zur Zeit besitzt die überwiegende Mehrzahl solcher Prüfmittel,
die für Reihenuntersuchungen im klinischen Labor oder in der Praxis des Arztes angewandt
werden, die Form von Teststreifen in Form länglicher Plastikstreifen, auf denen
ein oder
mehrere Reagentienträger befestigt sind. Derartige Reagensträger
bestehen üblicherweise aus Stücken von saugfähigem Papier, die mit einer oder mehreren
geeigneten Chemikalien imprägniert sind, die, wenn sie mit einer wäßrigen flüssigen
Probe, die den nachzuweisenden Bestandteil enthält, in Berührung kommen zu einer
Farbänderung oder kolometrischen Reaktion führen.
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Für Urinuntersuchungen geeignete Prüfmittel sind solche vom "dip-and-read"-Typ,
die innerhalb 1 min qualitative oder halbquantitative Farbreaktionen ergeben, wenn
sie einen Augenblick in die Urinprobe getaucht werden.
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Urinbestandteile, die üblicherweise auf diese Weise bestimmt werden,
umfassen Glucose, Proteine, Ketone, okkultes Blut, Bilirubin, Urobilinogen und Nitrit.
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Die schnelle bequeme und zuverlässige halbquantative Bestimmung solcher
Substanzen, die sich im Urin finden, ist ein außerordentlich nützliches Hilfsmittel
zur Beurteilung des allgemeinen Zustands eines Patienten bezüglich vieler wichtiger
klinischer Erscheinungen.
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Bei der Analyse von Blutproben wurde das Problem, der Störung der
farbbildenden Testreaktion durch das Vorhandensein gefärbter Blutkörper besonders
Erythrocyten überwunden, indem die Reagensträgermatrix mit einer Trennschicht umgeben
worden ist, die für rote Blutkörperchen undurchlässig ist, aber einen Durchgang
der nachzuweisenden Blutbestandteile in die Matrix ermöglicht. Derartige Erythrocyten-Barrieren
besitzen üblicherweise die Form von Membran überzügen oder Folien über dem freiliegenden
Teil des saugfähigen, mit Reagens imprägnierten Kissens. Es ist auch bekannt, daß
Prüfmittel zur Un-tersuchung von ganzem Blut so hergestellt werden können, daß die
Reagensträgermatrix
selbst so ausgebildet ist, daß sie eine gesteuerte
begrenzte Porosität besitzt, die ein Eindringen roter Blutkörperchen vermeidet.
Üblicherweise wird ein Tropfen der Blutprobe auf die Oberfläche des mit Reagens
imprägnierten Kissens gegeben und nach ungefähr 1 min oder länger wird die Oberfläche
abgespült, abgestreift oder auf andere Weise behandelt, um die störenden färbenden
Teilchen zu entfernen. Die Farbreaktion wird dann abgelesen nach einer Zeit von
1 min oder darüber für die Farbentwicklung. Abnorme Gehalte an Glucose, Harnstoff
und Harnsäure sowie anderen Blutkomponenten werden üblicherweise mit derartigen
Prüfmitteln nachgewiesen. Prüfmittel vom "dip-and-read"-Typ sind auch geeignet zur
Untersuchung von anderen Flüssigkeiten als Körperflüssigkeiten. tlblicherweise werden
pH-Testpapiere usw. außerordentlich verbreitet für verschiedene technische Bereiche
angewandt. Es ist bekannt, daß es wichtig ist, das Vorhandensein oder die Menge
bestimmter Bestandteile einer Vielzahl von industriellen Flüssigkeiten, wie Fermentationsbrühen,
Schmierölen, Elektroplattierbädern usw. zu bestimmen. Während bei der weiteren Beschreibung
im wesentlichen auf biologische Flüssigkeiten Bezug genommen wird, ist festzustellen,
daß die entscheidenden Vorteile des erfindungsgemäßen Prüfmittels auch auf die Untersuchung
von industrieBen und sonstigen Flüssigkeiten anwendbar sind.
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Beispiele für "dip-and-read"-Prüfmittel, wie sie für die Urinuntersuchung
angewandt werden, sind in den US-PS 3 048 475, 3 095 277, 3 122 420, 3 164 534,
3 447 905, 3 585 001, 3 814 586 und 3 814 688 angegeben. Bei der Herstellung all
dieser Prüfmittel wird ein saugfähiger Träger, üblicherweise ein Kissen aus absorbierenden
Papier, wie Filterpapier, mit einer Lösung oder Suspension, enthaltend das Testreagens
oder die Reagentien,imprägniert und anschließend sorgfältig getrocknet. Beim Zusammenbringen
des
Prüfmittels mit der Blüssigkeitsprobe, die die nachzuweisende Substanz enthält,
wird das Papier-Reagens rehydratisiert und es wird möglich, daß die farbbildende
Reaktion abläuft.
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Bei der Herstellung und Anwendung derartiger Prüfmittel auf Papierbasis
treten bestimmte Nachteile bei der Herstellung und in dem Produkt auf. Ein Hauptgrund
hierfür sind die Unterschiede in der Struktur und Zusammensetzung von Papierprodukten,
die im Handel erhäLtlich sind.
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Außerdem können einige Reagens systeme nicht mit gutem Erfolg in den
Papierkissen angewandt werden aufgrund des Vorhandenseins störender Substanzen in
dem Papier oder der Instabilität des Papieres, wenn es stark sauren, stark alkalischen
oder anderen aggressiven Reagens systemen ausgesetzt ist. Die Qualitätskontrolle,
die sehr kritisch ist, wenn das Endprodukt als Hilfsmittel für medizinische Diagnosen
angewandt werden soll, ist kompliziert aufgrund der Variabilität des zur Zeit für
Prüfmittel angewandten handelsüblichen Papiers.
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Beispiele für Prüfmittel, die besonders geeignet sind zur Bestimmung
von Bestandteilen von ganzem Blut auf grund des Vorhandenseins eines semipermeablen
Überzugs oder einer Membran auf der Oberfläche des trockenen, mit Reagens imprägnierten
Papierkissens sind in den US-PS 3 092 465, 3 145 086, 3 298 789, 3 395 082, 3 427
225, 3 493 346 und 3 592 741 beschrieben.
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In der US-PS 3 607 093 ist ein Prüfmittel beschrieben zur Untersuchung
von ganzem Blut, umfassend eine für Flüssigkeit durchlässige, aber für Erythrocyten
undurchlässige Membran, in der ein Testreagens enthalten ist. Das Testreagens ist
in die Membran, wie eine Celluloseacetat-Diffusionsmembran durch Imprägnieren der
Membran mit einer
Lösung des Testreagenses und anschließendes Trocknen
eingebracht worden. Das entstehende Prüfmittel ist verhältnismäßig nicht porös und
nicht absorbierend, da es speziell dazu bestimmt ist, die Diffusion von Bestandteilen
der zu untersuchenden Probe,besonders von Erythrocyten, in die das Reagens enthaltende
Membran zu steuern. Bei der beschriebenen Anwendung des Prüfmittels wird ein Tropfen
Blut auf die Membran aufgebracht und mindestens 2 min stehengelassen, bevor die
Probe abgestreift wird. Weitere 30 s sind erforderlich, bevor eine sichtbare Farbreaktion
auftritt. So erfordert dieser Test zumindest 2 1/2 min von dem Zeitpunkt an, zu
dem die Probe mit dem Prüfmittel in Berührung gebracht wird, bis eine ablesbare
Reaktion auftritt. Eine so lange Testzeit ist sehr unbequem bei Urinuntersuchungen.
Außerdem macht eine Verweilzeit der Probe von 2 min, wie sie für das bekannte Prüfmittel
erforderlich ist, dieses ungeeignet für "dip-and-read"-Verfahren, bei denen das
Prüfmittel und die Probe nur kurz zusammengebracht werden.
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Es ist offensichtlich, daß die Art der Reagensträgermatrix, wie sie
in der US-PS 3 607 093 angegeben ist, allgemein ungeeignet ist für Urinuntersuchungen,
da sie nicht saugfähig ist und dadurch eine verhältnismäßig lange Verweilzeit der
Probe und Zeit bis zum Ablesen benötigt.
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Eine andere Art von Prüfmittel ist in der US-PS 3 630 957 beschrieben
in Form einer homogenen wasserbeständigen Folie, in der ein farbbildendes Testreagens
gleichmäßig verteilt ist. Die Folie wird hergestellt durch Trocknen eines Gemisches
aus einer wäßrigen Suspension oder einer organischen nicht-wäßrigen Lösung eines
organischen filmbildenden Polymers und des Testreagenses. Die entstehende dichte
Folie, in der das Reagens
enthalten ist, ist verhältnismäßig nicht
porös und nicht absorbierend, da sie aus einer einphasigen Polymerlösung oder Suspension
hergestellt worden ist. Folien, die auf diese Weise hergestellt worden sind, besitzen
Porositäten von weniger als 0,1/um. Eine so geringe Porosität ist gut geeignet zum
Nachweis von Bestandteilen von ganzem Blut, da sie wirksam die Brythrocyteidaran
hindert, in die Reagensträgermatrix einzudringen. Ein solches Prüfmittel ist jedoch
nicht geeignet zur Anwendung bei Urinuntersuchungen, da die erforderlichen Testzeiten
über 2 min hinausgehen und die erforderliche Verweilzeit bei weitem diejenige überschreitet,
die durch ein augenblickliches Eintauchen in die Testprobe entsprechend einem "dip-alld-read"-Verfahren
erforderlich ist.
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Ein Prüfmittel zum Nachweis von Aldehyden in wäßrigen Lösungen ist
in der US-PS 3 784 358 beschrieben. Dieses Prüfmittel besteht aus einer porösen
polymeren Unterlage, auf der ein chromogenes Testreagens adsorbiert ist.
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Beispiele für derartige poröse polymere Unterlagen sind poröses Polyäthylen,
Polypropylen, Nylon und Polystyrol und sie werden hergestellt durch Verfahren, die
spezielle Techniken und Vorrichtungen erfordern. Das auf dem polymeren Träger adsorbierte
Testreagens ist verhältnismäßig ungeschützt gegenüber der schädigenden Wirkung der
Atmosphäre, da die Poren der Unterlage verhältnismäßig groß sind in der Größenordnung
von 30 bis 60 µm und das Reagens nur auf der freien Oberfläche der Unterlage adsorbiert
ist Verschiedene andere bekannte Prüfmittel verwenden strukturelle Kombinationen
von saugfähigen Trägern, Folien und Membranen,
| renden |
| hydrophobie#Mitteln |
usw., wie in den US-PS
3 232 710, 3 418 083, 3 443 903, 3 798 004
und 3 811 840 sind angegeben#Bei keinem dieser Prüfmittel ist jedoch der Einbau
eines Testreagenses in ein anderes Strukturglied als einen Träger aus absorbierendem
Papier angegeben.
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Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Prüfmittel zu
entwickeln, das eine synthetische Reagensträgermatrix besitzt, in der eine chemische
Testsubstanz eingebaut ist und das besonders geeignet ist für "dip-and-read"-Analysen
von biologischen Flüssigkeiten, besonders Urin und bei dem man das Testergebnis
innerhalb 1 min nach der Berührung mit der zu untersuchenden flüssigen Probe ablesen
kann. Das Prüfmittel soll billig hergestellt werden können und es soll eine geringere
Qualitätskontrolle der Ausgangsmaterialien erforderlich sein, als bei den bekannten
Prüfmitteln.
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Die erfindungsgemäße Reagensträgermatrix soll eine verhältnismäßig
hohe Absorptionsfähigkeit, d.h. Saugfähigkeit, gegenüber der zu untersuchenden Flüssigkeit
besitzen und eine innere membranartige Struktur mit verhältnismäßig großen inneren
Hohlräumen (Poren), eine große Gleichmäßigkeit bezüglich der Struktur und Zusammensetung
zwischen einzelnen Chargen der Herstellung, Stabilität in Gegenwart bestimmter üblicher
flüssiger Reagenstestsysteme und Einheitlichkeit, wie sie erforderlich ist für genaue
und zuverlässige instrumentelle Untersuchungen der auftretenden Reaktion.
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Diese Aufgabe wird gelöst durch eine synthetische polymere, durch
Phasenumkehr erhaltene Reagensträgermatrix, in der eine Testsubstanz oder ein Testsystem
eingebaut ist, das auf die in der flüssigen, zu untersuchenden Probe nachzuweisende
Substanz oder den nachzuweisenden Zustand anspricht.
Die membranartigen,
durch Phasenumkehr erhaltenen Reagensmatrices besitzen die allgemeine saugfähige
und benetzbare . lstur derüblichen Papiermatrices und können synthetisch unter geregelten
Bedingungen hergestellt werden. Diese neuen Reagensträgermatrices haben sich als
fähig erwiesen, ein genaues Testergebnis innerhalb von weniger als 1 min nach dem
Eintauchen oder der Berührung mit der zu untersuchenden flüssigen Probe zu ergeben.
Die Erfindung betrifft daher ein sehr günstiges und vorteilhaftes Prüfmittel vom
"dip-and-read"-Typ, das besonders geeignet ist zur Untersuchung von Körperflüssigkeiten,
wie Urin. Das erfindungsgemäße Prüfmittel kann auch angewandt werden, zur Untersuchung
von Flüssigkeiten, die ein vorheriges Filtrieren erforderlich machen, wie z.B. ganzem
Blut.
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Die erfindungsgemäße Reagensträgermatrix wird durch Phasenumkehrausfällung
eines gelösten Polymers erhalten.
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Der Ausdruck "durch Phasenumkehr erhaltene Matrix" gezeichnet eine
Matrix, -die erhalten worden ist durch ein Phasenumkehr-Ausfäll-Verfahren oder die
durch die gleichen wesentlichen Merkmale gekennzeichnet ist, wie eine so hergestellte
Matrix. Solche wesentlichen Merkmale, deren wichtigste später im einzelnen diskutiert
werden, können allgemein als solche definiert werden, die direkt zu der Eignung
von Matrices beitragen, die durch Phasenumkehr-Ausfällverfahren hergestellt worden
sind, wie die Prüfmittel der hier beschriebenen Art.
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Die erfindungsgemäße Reagensträgermatrix wird vorzugsweise hergestellt
unter Anwendung von Phasenumkehr-Membranherstellungsverfahren. Phasenumkehrmembranen
können hergestellt werden durch gesteuerte Ausfällung von mindestens einem Polymer
aus einem Lösungsmittelsystem. Das Test-+) bzw. ''Phaselzumkehr-Ilatrix''
reagens
oder Testsystem wird in die Phasenumkehr-Trägermatrix im allgemeinen auf eine der
folgenden Weisen eingebaut: (a) Die Phasenumkehrmatrix wird hergestellt und anschließend
das Testreagens oder Testsystem sowie irgendwelche gegebenenfalls vorhandene Zusätze,
wie sie später näher diskutiert werden, durch Imprägnieren und Trocknen, physikalisches
oder chemisches Kuppen oder Adsorbieren usw. oder durch eine Kombination und/oder
eine Reihe derartiger Schritte1 eingebaut. Diese Herstellungsverfahren umfassen
die üblichen echniken,wie sie zum Einbau in bekannte Papierträger polymerer Folie
und Vliesträger usw. angewandt werden, um die Testreagentien durch ein nachträgliches
Imprägnieren oder eine andere Behandlung der fertigen rägermatrix einzubauen; (b)
die Phasenumkehrmatrix wird aus einem Lösungsmittelsystem hergestellt, enthaltend
das Testreagens oder Testsystem und weitere gegebenenfalls vorhandene Zusätze, wie
sie später näher beschrieben sind. Dieses Verfahren, das hier als in siu-Phasenumkehr-Ausfällverfahren
bezeichnet wird, stellt ein Mittel dar zur Herstellung eines besonders vorteilhaften
Prüfmittels, wie später näher erläutert wird, (c) gegebenenfalls können verschiedene
Kombinationen der beiden oben angegebenen Verfahren zur Herstellung des Prüfmittels
angewandt werden. Z.B.
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können in die Phasenumkehrmatrix zunächst ein oder mehrere Testreagentien
oder Komponenten des Testsystems
und einer oder mehrere der gegebenenfalls
vorhandenen Zusätze eingebaut werden, indem man derartige Substanzen in das Lösungsmittelsystem
gibt, aus dem die Phasenumkehrmatrix ausgefällt wird. Anschließend kann die Phasenumkehrmatrix
mit den restlichen Testreagentien oder Komponenten des Test systems oder gegebenenfalls
vorhandenen weiteren Zusätzen versehen werden, entsprechend einer oder mehrerer
Verfahrensstufen, wie sie unter (a) angegeben sind.
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Um eine Phasenumkehr-Trägermatrix herzustellen, muß das Polymer oder
die Polymeren in einem Lösungsmittelsystem löslich sein, das zumindest ein echtes
Lösungsmittel und zumindest ein schwaches Lösungsmittel und/oder Nichtlösungsmittel,
das eine geringere Affinität zu dem Polymer oder den Polymeren besitzt, als ein
echtes Lösungsmittel enthält. Das Lösungsmittelsystem enthält gegebenenfalls eine
Lösung,Suspension oder Dispersion des Testreagenses und/oder gegebenenfalls vorhandener
weiterer Zusätze. Das Polymer oder die Polymere müssen auch eine bestimmte minimale
Polarität besitzen und daher eine bestimmte Oberflächenaktivität. Die Polymerlösung
wird auf ein geeignetes Substrat aufgegossen, aufgesprüht, aufgerollt oder auf andere
Weise auf gebracht. Wenn die entstehende Matrix von dem Substrat entfernt werden
soll, wird diese Entfernung erleichtert durch Anwendung eines Substrates, das von
dem Lösungsmittel nicht benetzt wird oder demgegenüber inert ist, z.B. eines Glassubstrates.
Wenn die entstandene Matrix und das Substrat eine integrale Struktur bilden sollen,
wird ein Substrat ausgewählt, das imstande ist, chemisch oder physikalisch mit dem
Polymer zu kuppeln oder teilweise in dem Polymerlösungsmittelsystem löslich ist
oder dieses
absorbieren kann. Absorbierende flächige Materialien
oder ein geeignetes Kunststoffmaterial, das in dem Polymer-Lösungsmittel-System
teilweise löslich ist, sind für solche Substrate geeignet. Die abgeschiedene Polymerlösung
wird nach einem von zwei Grundverfahren von Lösungsmitteln befreit (desolvatisiert):
(aj Im wesentlichen durch vollständiges Verdampfen oder (b) teilweises Verdampfen
und anschließendes Eintauchen in ein Nichtlösungsmittel und anschließende Entfernung
der restlichen Lösungsmittel. Aufgrund des Vorhandenseins eines schwachen und/oder
Nichtlösungsmittels trennt sich das anfangs homogene Lösungsmittelsystem mit fortschreitender
Verdampfung in zwei miteinander vermischte flüssige Phasen, d.h. ein Koazervat.
Das Koazervat umfaßt mit Polymer überzogene Tröpfchen der einenPhase, die in eine
Matrix aus der zweiten Phase eingebettet sind.
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Wenn die Verdampfung weiter fortschreitet, bevor sie jedoch vollständig
ist, geht das Polymers in eine Gelphase über. Die vollständig gebildete Phasenumkehrmembran
oder -matrix wird erhalten, nachdem das Lösungsmittelsystem im wesentlichen vollständig
verdampft ist oder nach dem Eintauchen in ein Nichtlösungsmittel.
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Bei dem Phasenumkehrverfahren ist der Übergang vom Sol-in den Gelzustand
eher nach und nach als plötzlich.
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So reduzieren sich während des Sol-Gel-0bergangs des Koazervats die
Koazervattröpfchen zu Polyedern die schließlich das Gitter der fertigen Membran
darstellen. Dadurch erhält man eine stark poröse polymere Struktur. die ein deutlich
größeres Hohlraumvolumen dichten (Porosität) besitzt, als dies der bekanntení/Eolymertollen,
die durch Ausfällung aus einer einphasigen Lösung oder Suspension des Polymers erhalten
worden sind. Ein Hohlraumvolumen von mehr als 50 % des Gesamtvolumens der Matrix
kann
durch ein Phasenumkehr-Ausfällverfahren leicht erreicht werden. In erster Linie
aufgrund des Lösungsmittelverlustes ist die Dicke der entstehenden Matrix nur ein
Bruchteil der Dicke der abgeschiedenen Polymerlösung. Aufgrund des Einschlusses
von Hohlräumen oder Poren besitzt die Phasenumkehrmatrix jedoch eine Dicke, die
wesentlich größer ist als diejenige einer dichten Folie, die hergestellt worden
ist durch Abscheiden einer äquivalenten Menge und Art des Polymers aus einem einphasigen
Medium.
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Sowohl die ursprüngliche Polymerlösung als auch die äußeren Faktoren
während des Verdampfens können innerhalb weiter Grenzen variiert werden, um die
Bildung der durch die Phasenumkehr entstandenen Gelstruktur und damit der Struktur
der fertigen Matrix zu regulieren. Im allgemeinen ergibt eine Erhöhung der Konzentration
an schwachem Lösungsmittel oder Nichtlösungsmittel oder Verringerung des echten
Lösungsmittels in der Polymerlösung kleinere und zahlreichere Hohlräume. Während
der Verdampfung führt eine Erhöhung entweder der Temperatur oder der relativen Feuchtigkeit
der Umgebung im allgemeinen zu einer größeren Porengröße.
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Für ein spezielles Polymer oder Polymergemisch können die Lösungsmittel
in einem Löslichkeitsspektrum angeordnet werden,das von echten Lösungsmitteln oder
Dispersionsmitteln über schwache Lösungsmittel, die manchmal auch als Quellmittel
bezeichnet werden, schwache Ausfällmittel oder Gelbildner zu Nichtlösungsmitteln
oder Ausfällmitteln reicht. Da eine große Anzahl bekannter Polymerlösungsmittel
existiert, ist eine Polymerlösung, die zu einer Ausfällung durch Phasenumkehr bei
Verdampfung geeignet ist, im allgemeinen leicht verfügbar für ein bestimmtes Polymer
oder Polymergemisch , das mit dem Prüfmittel oder Prüfmittelsystem,
das
in die fertige Matrix nach dem in situ-Verfahren eingebaut werden soll, verträglich
ist Um eine Faustregel aufzustellen zur Bestimmung, ob ein Lösungsmittel als echtes
Lösungsmittel oder Nichtlösungsmittel zu betrachten ist, wobei der zuletzt genannte
Ausdruck schwache Lösungsmittel und echte Nichtlösungsmittel umfaßt, kann die Beziehung
zwischen den Löslichkeitsparametern für das spezielle Polymer und Lösungsmittel.angewandt
werden. Lösungamittelparameter sind bekannte geeignete Hilfsmittel in der Polymertechnologie
und sind im Polymer Handbook, herausgegeben von Brandrup et al, Interscience Publishers
(New York, 1967) definiert, diskutiert und angegeben. Für die erfindungsgemäßen
Zwecke kann man sagen, daß ein Lösungsmittel mit einem Löslichkeitsparameter innerhalb
von 2 Einheiten von demjenigen eines speziellen Polymers als echtes Lösungsmittel
für das Polymer angesehen werden kann. Solche Lösungsmittel, die Löslichkeitsparameter
außerhalb dieses Bereichs haben, können als Nichtlösungsmittel angesehen werden,
wobei die echten Nichtlösungamittel solche sind, deren Löslichkeitsparameter mehr
als 5 Einheiten von demjenigen des ausgewählten Polymers entfernt liegen.
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Das erfindungsgemäße Phasenumkehr-Polymer-Ausfällverfahren ergibt
eine Reagensträgermatrix, die stark porös und in Beziehung auf die zu untersuchende
Flüssigkeit saugfähig ist. Der Flüssigkeitstransport in die entstehende, das Reagens
enthaltende Polymermatrix sowie innerhalb der Matrix wird stark erleichtert aufgrund
der inneren offenzelligen Struktur. Das durch in situ-Phasenumkehr-Ausfällverfahren
hergestellte Prüfmittel besitzt verschiedene besonders vorteilhafte Eigenschaften.
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Ein derartiges Prüfmittel ist gekennzeichnet durch die Tatsache, daß
während die Testflüssigkeit leicht an die innere Oberfläche der Matrix gelangen
kann und damit an das eingebaute Reagens, dieses Reagens verhältnismäßig
gleichmäßig
und fest in der stark porösen Struktur der Membran immobilisiert ist und nicht leicht
ausgelaugt werden kann, da es sowohl physikalisch åls auch chemisch eng mit dem
Polymermate-rial, das die Struktur der Matrix bildet, verbunden ist. Die Phasenumkehr-Reagensträgermatrix
besitzt im allgemeinen eine hohe Gleichmäßigkeit sowohl an der Oberfläche als auch
entlang einer dazu parallelen Ebene, wodurch die Gleichmüßigkeit der Testreaktion
über die Oberfläche verbessert wird.
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Eine stärker ins Einzelne gehende Diskussion des Phasenumkehrverfahrens
der relevanten Faktoren, die die Membranbildung beeinflussenund Verfahren zur weiteren
Behandlung der entstandenen Membran sind angegeben in Kesting, R.E., Synthetic Polymer
Membranes, McGraw-Hill, Inc. (New York, 1971). Eines der überraschendsten Merkmale
der Erfindung ist, daß das vielseitig anwendbare Phasenumkehrverfahren angewandt
werden kann zur Herstellung von neuen Reagensträgermatrices, die sehr geeignet sind
zur schnellen und bequemen Untersuchung von Flüssigkeiten.
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Der allgemeine makroskopische und mikroakopische Charakter der erfindungsgemäßen
Reagensmatrix entspricht in manchen Beziehungen demjenigen üblicher Papiermatrices.
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Die Reagensmatrix ist stark durchlässig für die zu untersuchende Probe
und ergibt eine starke und wirksame physiochemische Wechselwirkung zwischen den
Bestandteilen der zu untersuchenden Probe und dem Testreagens oder Reagens system
in der Matrix. Die Wechselwirkung zwischen den Bestandteilen der Probe und dem Testreagens
wird verstärkt durch den allgemeinen saugfähigen Charakter der Matrix, d.h. durch
die Fähigkeit der Matrix, die flüssige Probe zu absorbieren oder adsorbieren und
verhältnismäßig
große Volumina der Probe innerhalb der Matrix festzuhalten.
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Die Fähigkeit der synthetischen Reagensträgermatrixi Flüssigkeiten
in einer Weise und einem Ausmaß zu absorbieren und festzuhalten, die denjenigen
üblicher Papiermatrices entsprechen, beruht in erster Linie auf ihrer Hydrophilie
und membranartigen inneren Struktur, die durch eine hohe Porosität und ein hohes
Porenvolumen gekennzeichnet ist. Im Gegensatz zu den dichten Reagensfolien, die
im wesentlichen kontinuierliche zusammenhängende innere Strukturen besitzen, besitzt
die erfindungsgemäße Matrix miteinander verbundene offenzellige und/oder dünnwandige
Hohlräume, die in großer- Menge vorhanden und groß sind und eine stark entwickelte
Membranstruktur bilden. Üblicherweise besitzt die erfindungsgemäße Reagensträgermatrix
ein Porenvolumen von mehr als ungefähr 30 %, vorzugsweise mehr als ungefähr 70 ,
bezogen auf das Gesamtvolumen der Matrix und eine mittlere Porengröße von mehr als
ungefähr 1/um, vorzugsweise mehr als ungefähr 3,0/um.
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Die mittlere Porengröße der Trägermatrix ist im allgemeinen kleiner
als 30/um und vorzugsweise weniger als 20/um. Aufgrund der allgemeinen saugfähigen
Natur ist die-erfindungsgemäße Reagensträgermatrix imstande, eine Menpe der flüssigen
zu untersuchenden Probe zu z urnlnde8t absorbieren1 dievgthrem Eigengewicht entspricht
und vorzugsweise mehr als zweimal so groß ist. In verschiedener Hinsicht kann die
erfindungsgemäße Reagensträgermatrix als ein synthetisch hergestelltes papierartiges
Material angesehen werden. Daher besitzen die erfindungsgemäBen Matrices die vorteilhaften
Absorptionseigenschaften üblicher Papiermatrices mit dem wesentlichen Vorteil, daß
das erfindungsgemäße Matrixmaterial selbst synthetisch hergestellt werden kann.
Dadurch werden die Nachteile des
Papiers erfindungsgemäß durch
die Vorteile gut charakterisierter synthetischer Polymerer ersetzt.
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Synthetische Polymere, die für die erfindungsgemäße Reagensmatrix
angewandt werden kännen, umfassen die gegenüber der zu untersuchenden Flüssigkeit
unlöslichen Formen solcher Polymere, wie Polyacrylate, wie Polyacrylonitril, Polybutylacrylat,
Polyacrylat und Polymethacrylat; die Polyoxide, wie Polyacetaldehyd, Polyformaldehyd
und Polytetrahydrofuran; die Polyester, wie Polyäthylenterephthalat, die Polyamide,
die Polyurethane, die Polyvinyle, wie Polyvinylacetat, Polyvinylalkohol, Polyvinylchlorid
und Polyvinylpropionat und deren Derivate und Gemische. Besonders geeignet sind
die in den Testflüssigkeiten unlöslichen synthetischen Polysaccharide, besonders
die Celluloseprodukte und ihre Derivate, wie die Celluloseäther, wie Methylcellulose,
Äthylcellulose, Propylceliulose und Butylcellulose; die Celluloseester, wie Celluloseacetat,
Cellulosebutyrat, Celluloseacetatbutyrat, Celluloseacetatpropionat und Celluloseacetat-hydrogenphChalat
und andere, wie Cellulosenitrat.
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Der Ausdruck Reagens, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf
eine chemische Verbindung oder ein Mittel, das physikalisch oder chemisch auf einen
oder mehrere der im der zu untersuchenden flüssigen Probe vorhandenen Bestandteile
oder einen Zustand der flüssigen Probe unter Bildung einer nachweisbaren Reaktion
reagiert.
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Eine solche nachweisbare Reaktion (response) kann unmittelbar nach
der Berührung mit derzu untersuchenden Probe oder eine gewisse Zeit danach auftreten.
Eine solche Reaktion wird als nachweisbar bezeichnet, wenn die physikalische oder
chemische Wirkung durch eine zusätzliche physikalische oder chemische Behandlung
oder ohne eine
solche mit Hilfe der menschlichen Sinne oder auf
andere Weise, z.B. instrumentell, nachgewiesen werden kann.
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Die nachweisbare Reaktion kann daher eine spektrophotometrische, turbidometrische
(Trübungsmessung), radioaktive, thermische oder andere Reaktion sein. Üblicherweise
ist die Reaktion eines Testreagenses ein Farbwechsel, vorzugsweise im sichtbaren
Bereich. Das erfindungsgemäße Prüfmittel ist geeignet zum Nachweis einer Anzahl
von Substanzen in flüssigen Proben, z.B. Urin- oder Blutproben. Die klinisch bedeutsamen
Substanzen, die in solchen biologischen Flüssigkeiten vorhanden sein können, umfassen
Glucose, Albumin bzw. Proteine, Wasserstoffionen, Erythrocyten, Hämoglobin, Bilirubin,
Urobilinogen, Nitritionen, Ketone:, Harnstoff, Harnsäure, Cholesterin, Mikroorganismusmetaboliten
und Zellbestandteile usw.
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Die Trägermatrix kann auch weitere übliche, gegebenenfalls vorhandene
Zusätze enthalten. Derartige Zusätze umfassen inerte Füll-stoffe, Verdickungsmittel,
Weichmacher, die Festigkeit erhöhende Harze, inerte Hintergrundfarbstoffe und Pigmente
usw.; wenn das polymere Material, das zur Herstellung der Trägermatrix angewandt
wird, keine starke Affinität zu der zu untersuchenden flüssigen Probe besitzt, kann
ein oberflächenaktives Mittel oder Netzmittel zu der Matrix zugesetzt werden, das
imstande ist, ihr eine derartige Affinitä-t zu verleihen, um die Absorption oder
das Eindringen der Flüssigen zu untersuchenden Probe in die Trägermatrix, nachdem
sie mit der Probe in Kontakt gekommen ist, zu erleichtern. Z.B. stehen . für den
Fall, daß die zu untersuchende Probe eine wäßrige Probe ist und das polymere Material,
das zur Herstellung der Trägermatrix angewandt wird, hydrophob oder nicht hydrophil
ist, geeignete oberflächenaktive Mittel oder Netzmittel zur Verfügung, die in die
Matrix entweder
während ihrer Herstellung oder durch eine Nachbehandlung
eingebracht werden kEnnen, um ihr einen hydrophilen Charakter zu verleihen; einer
Matrix aus einem hydrophoben Polymer kann die Absorptionsfähigkeit verliehen werden
durch den Einbau von Teilchen eines geeigneten absorbierenden Materials während
der Herstellung.
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Die Trägermatrix ist üblicherweise für die leichtere Handhabung mit
einer Unterlage verbunden. Geeignete Prüfmittel können hergestellt werden, indem
man die Trägermatrix mit Hilfe von Klebemitteln oder auf anderer Weise oder durch
Bildung der~Reagensmatrix direkt auf dem Substrat befestigt, um eine integrale Struktur
zu erhalten. Das zuletzt genannte Verfahren kann durchgeführt werden, indem man
ein Lösungsmittelsystem auswählt, aus dem die Phasenumkehrmatrix gebildet-wird und
eine Unterlage, die chemisch oder physikalisch mit dem Lösungsmittelsystem reagiert.
Z.B. kann ein Lösungsmittel ausgewählt werden, das die Oberfläche der Unterlage
teilweise löst, so daß bei Verdampfung des Lösungsmittels die entstehende Phasenumkehrmatrix
integral mit der Unterlage verbunden oder verschmolzen ist.
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Die Unterlage bzw. das Substrat besitzt im allgemeinen die Fornf eines
Streifens aus Kunststoff, Papier, Holz, Metallfolie oder ähnlichem.Da die Trägermatrix
mit oder ohne Testreagens direkt aus einer Flüssigkeit hergestellt werden kann,
ist jedoch eine große Variation in den Formaten des Prüfmittels möglich.
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Üblicherweise liegt die rägermatrix in Form eines dünnen Films bzw.
einer Folie oder Membran vor> die in laminatartiger Weise auf einem inerten Streifen
oder Substrat befestigt ist. Der Streifen dient dabei als Unterlage oder Griff für
die Matrix. Eine einzige Reagensträgermatrix oder
verschiedene
derartige Matricen können auf einem Streifen befestigt sein. Ein Prüfmittel für
verschiedene Untersuchungen kann hergestellt werden, indem auf ainem Streifen eine
Vielzahl von Matrices befestigt ist, die jeweils ein anderes Testreagens oder Reagenssystem
enthalten.
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Eine andere Form von Prüfmittel, die mit Hilfe der erfindungsgemäßen,
mit Reagens imprägnierten Trägermatrix hergestellt werden kann, ist ein Prüfgefäß,
dessen Innenseite ganz oder teilweise mit der Trägermatrix überzogen ist. Solche
Gefäße können Reagensgläser, Schalen, Kapillarröhrchen, analytische Säulen, dicht
verschließbare Kapseln oder ähnliches sein und bei der Anwendung wird die zu untersuchende
Probe in ein solches Gefäß gegeben und bei der Berührung der Probe mit der Trägermatrix
beginnt die Testreaktion.
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Es ist möglich, dünne, folienartige Reagensträgermatrices der beschriebenen
Art laminatartig auf einanderzulegen zur Bildung einer aus Schichten bestehenden
oder sandwichartigen Struktur. Bei einem solchen schichtenförmigen Prüfmittel können
die einzelnen Matrixschichten Testreagentien enthalten, die auf die gleichen oder
unterschiedliche zu bestimmende Substanzen ansprechen oder die einzeln auf unterschiedliche
Arten oder Gruppen von Verbindungen ansprechen. Gegebenenfalls können semipermeable
oder selektive Trennschichten oder Membranen zwischen benachbarte Matrixschichten
eingefügt werden, um den Transport von Substanzen zu steuern.
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Einige sehr vorteilhafte Merkmale der erfindungsgemäßen Reagensmatrix
bestehen in der gesteuerten Porosität und
hohen Durchlässigkeit
und Saugfähigkeit gegenüber der zu untersuchenden Flüssigkeit. Man erhält daher
eine Struktur, in der sich ein Reagens befindet, die durch ihre physiochemische
Natur wirksam den Flüssigkeitstransport innerhalb der Reagensmatrix erleichtert
für eine schnelle und thermodynamisch günstige Wechselwirkung zwischen dem Testreagens
und der flüssigen Probe. Die stark poröse Reagensmatrix erleichtert auch das Eindringen
von atmopshärischem Sauerstoff in das Innere der Struktur. Das ist von besonderer
Wichtigkeit, wenn die angewandte Testreaktion aerob ist. Flüssigkeiten, die mit
Hilfe des erfindungsgemäßen Prüfmittels untersucht werden können, umfassen natürlich
vorkommende und künstlich hergestellte Lösungen, Dispersionen oder Suspensionen.
Das erfindungsgemäbe Prüfmittel ist besonders geeignet zur Untersuchung von biologischen
Flüssigkeiten, besonders solchen, bei denen keine Filtration erforderlich ist, wie
Urin, Serum, Plasma usw. ; außerdem kann die Porosität des erfindungsgemäßen Prüfmittels
so eingestellt werden, daß störende Substanzen in der zu untersuchenden Flüssigkeit
von dem inneren Bereich der Reagensmatrix ferngehalten werden können. Da das Phasenumkehrverfahren
zur Herstellung des erfindungsgemäßen Prüfmittels eine genaue Regelung der Porosität
der entstehenden Reagensmatrix ermöglicht, kann der Eintritt von Substanzen aus
der zu untersuchenden Flüssigkeit in die Reagensmatrix ebenfalls leicht geregelt
werden.
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Besonders wichtig ist die Tatsache, daß das erfindungsgemäße Prüfmittel,
wenn es so hergestellt wird, daß die mittlere Porengröße zwischen ungefähr 0,1 und
5,0,um eingestellt wird, es leicht zum Nachweis von Substanzen sowohl im Urin als
auch im Blut angewandt werden kann.
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Urinproben werden auf die üblichel' dip-and-read-Weise untersucht.
Proben
von ganzem Blut können untersucht werden, indem man die Reagensträgermatrix vorher
benetzt und anschließend eine bestimmte Zeit von weniger als 1 min mit der Blutprobe
in Berührung bringt. Die Blutprobe wird dann z.B. durch Abwaschen oder Abstreifen
entfernt und die Reaktion unmittelbar beobachtet. Aufgrund der statischen Ladung
der Oberfläche der Polymermatrix bleiben rote Blutkörperchen an der Oberfläche der
Reagensmatrix selbst nach dem Abwaschen adsorbiert, wenn die Matrix direkt mit der
Blutprobe in Berührung gebracht wird, ohne daß sie vorher benetzt worden ist.
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Dieses Problem wird jedoch überwunden, indem man ein antistatisches
Mittel zu der Matrix zusetzt. Ein solches antistatisches Mittel dient dazu, die
Ladungen an der Oberfläche der Matrix auszugleichen und ein Hängenbleiben der roten
Blutkörperchen an der Matrix zu verhindern, so daß sie leicht abgewaschen werden
können.
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Ganzes Blut kann auch mit einer stark porösen Form der erfindungsgemäßen
Reagensträgermatrix untersucht werden, die mit einem semipermeablen Film der üblichen
Art überzogen ist. Wenn man der Reagensträgermatrix ein antistatisches Mittel zusetzt,
das für Erythrocyten undurchlässig ist, erhält man erfindungsgemäß ein"dip-andread-Prüfmittel
zur direkten Untersuchung von ganzem Blut.
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Das ist mit den bekannten Prüfmitteln nicht möglich.
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Substanzen, die als antistatische Mittel geeignet sind, sind bekannt.
Derartige Substanzen sind im allgemeinen ionisch, wie quaternäre Ammoniumverbindungen
und Amine oder hydrophil, wie Polyglykole oder Äthylenoxidderivate. Bezüglich genauerer
Informationen über antistatische Mittel, ihre Zusammensetzung und Anwendung wird
auf SPE Journal, Bd. 29 (1973), 5. 28 bis 34 und 52 bis 55 verwiesen.
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Das erfindungsgemäße Prüfmittel besitzt die Vorteile der Pllexibilität
der Reagensträgermatrix, Gleichmäßigkeit der Matrix, was zu einer homogenen Testreaktion
führt, die besonders geeignet ist für eine genaue instrumentelle Analyse, wie Reflexionsspektrophotometrie'
der Möglichkeit verhältnismäßig stark alkalische oder stark saure oder aggressive
Reagentien in die Matrix einzubauen.
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Bei der Herstellung des erfindungsgemäßen Prüfmittels ist es vorteilhafterweise
möglich, die Reinheit des Ausgangsmaterials und die Qualität der Struktur und Zusammensetzung
der Reagensträgermatrix leicht zu überwachen. Alle diese Vorteile können mit Hilfe
der bekannten Verfahren und üblichen Reagensträger nicht erreicht werden.
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Die erfindungsgemäßen Prüfmittel können in reproduzierbarer Weise
innerhalb kritischer Grenzen bezüglich der Qualitätskontrolle hergestellt werden
und können für fürfdip-and-read Analysenverfahren angewandt werden. Derartige Prüfmittel
sind nach bekannten Verfahren nicht herstellbar.
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Außerdem betrifft die Erfindung ein bequemes Verfahren zur Herstellung
von Prüfmitteln, die stark absorbierend sind, wobei eine Phasenumkehrpolymermatrix
hergestellt wird, in der ein Testreagens enthalten ist. Da die entstehende Reagensträgermatrix
aus einem einzigen Lösungsmittel system hergestellt werden kann, können sehr verschiedene
Prüfmittel, Arten und Formen erhalten werden, bei denen die Reagensträgermatrix
saugfähig ist.
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Die Erfindung wird durch die folgenden nicht einschränkenden Beispiele
näher erläutert.
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Beispiel 1 Bei diesem Beispiel wurde ein Prüfmittel zum Nachweis von
Glucose hergestellt.
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Es wurde eine erste Lösung hergestellt, enthaltend die folgenden Bestandteile
in den angegebenen Mengen: Glucose-oxidase (4000 Einheiten/ml) 4,0 ml Peroxidase
(3000 Einheiten/mg) 0,289 g 2, 7-Diaminfluoren. 2HCl 0,277 g Ascorbinsäure 0,020
g Gantrez AN* 20,0 ml Tris-malonat -Puffer (pH 7,0) 10,0 ml Äthanol 30,0 ml Wasser
13,0 ml * Ein Mittel zum Löslichmachen eines ein äquimolares Copolymer aus Methylvinyläther
und Maleinsäureanhydrid (General Aniline and Film Corporation, New York).
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6,0 ml der wie oben hergestellten ersten Lösung und 3,Qnl Wasser
wurden dann 30,0 ml einer zweiten Lösung zugemischt, enthaltend: Äthylcellulose**
10,0 g Aceton 114,0 ml ** G-50 der Hercules, Inc., Wilmington, Delaware.
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Die entstehende Lösung wurde in einer Dicke von 1,27 mm (50 mil) mit
Hilfe eines Gardner's-Spachtels aufgebracht und unter Standardraumbedingungen getrocknet.
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Die entstehende Phasenumkehrpolymermatrix, die papierartig aussah,
wurde von dem Glassubstrat abgezogen und in ungefähr 12,7 mm große Blöcke oder Kissen
geschnitten. Die Kissen wurden dann mit Hilfe von doppelseitigem Klebeband auf Sunststoffstreifen
aufgeklebt. Der Bereich des Reagenskissens von sechs der entstehenden Teststreifen
wurde jeweils momentan in eine von sechs Urinproben getaucht, enthaltend verschiedene
bekannten Konzentrationen an Glucose. Man erhielt die folgenden Ergebnisse: Glucosekonzentration
Farbreaktion g/100 ml 0,0 gelblich-lederfarben 0,1 gelblich-grün 0,25 grünlich-blau
0,5 blaßblau 1,0 blau 2,0 tiefblau Auf diese Weise konnte gezeigt werden, dafS das
erfindungsgefäße Prüfmittel geeignet ist zum Nachweis von Glucose in einer flüssigen
Probe nach dem dip-and-read-Verfahren.
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Beispiel 2 In diesem Beispiel wurde ein P üfmittel zum Nachweis von
Albumin hergestellt.
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Es wurde eine Pufferlösung hergestellt, enthaltend die folgenden Bestandteile
in den angegebenen Mengen.
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Natriumcitrat 2 H20 8,4 g Zitronensäure . H20 14,0 g Wasser 195,0
ml 66 ml der entstehenden Lösung wurden dann mit 30 ml Methanol, enthaltend 50 mg
Tetrabromphenolblau vermischt.
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Die entstehende Lösung wurde auf einen pH-Wert von 3,3 gebracht. 15,0
ml der Lösung wurden mit 30,0 ml einer Polymerlösung vermischt, enthaltend 7,5 g
Celluloseacetat (398-3 von Eastman Kodak Co., Rochester, New York) in 54,0 ml Aceton.
Die entstehende klare Lösung wurde in einer Dicke von 1,0 mm auf eine Glasplatte
gegossen und wie im Beispiel 1 getrocknet, in Stücke geschnitten und auf Kunststoffstreifen
befestigt.
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Der Teil mit dem Reagenskissen von vier der entstehenden Teststreifen
wurde jeweils augenblicklich in eine von vier Urinproben getaucht, enthaltend verschiedene
bekannte Albuminkonzentrationen. Man erhielt die folgenden Ergebnisse: Albuminkonzentration
Farbreaktion mg/100 ml 0 blaßgelb 100 grünlich-gelb 300 gelblich-grün 1000 grün
So konnte gezeigt werden, daß das erfindungsgemäße Prüfmittel geeignet ist z1lr
Bestimmung von Albumin in einer flüssigen Probe ("dipp- and - read").
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B e i s p i e l 3 In diesem Beispiel wurde ein Prüfmittel zur Bestimmung
des
pH-Werts einer Flüssigkeit hergestellt.
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Es wurden zwei Lösungen hergestellt der folgenden Zusammensetzung:
Lösung A Methyl-Rot 13 mg Bromthymol-Blau 257 mg Äthanol 270 ml Wasser 400 ml Lösung
B Bromcresol-Rot 2 mg Äthanol 36 ml Wasser 54 ml 20 ml der Lösung B wurden dann
mit 10 ml der Lösung A vermischt. 3,0 ml der entstehenden Lösung wurden dann mit
4,0. ml einer 156/eigen (Gew./Gew.) Lösung von Celluloseacetat (398-3 der Eastman
Kodak Co.., Rochester, New York) in Aceton vermischt. Die entstehende klare Lösung
wurde entsprechend Beispiel 1 auf Glasplatten gegossen, getrocknet, in Stücke geschnitten
und auf Kunststoffstreifen befestigt.
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Die Teile mit dem Reagenskissen von fünf der entstehenden Teststreifen
wurden jeweils augenblicklich in eine von fünf Urinproben mit den folgenden bekannten
pH-Werten getaucht. Man erhielt die folgenden Ergebnisse: pH Farbreaktion 5,0 gelb-orange
6,1 gelb 7,0 blau-grün 7,9 grün-blau 8,9 tiefblau
So konnte gezeigt
werden, daß das erfindungsgemäße Prüfmittel geeignet ist zur Bestimmung des pH-Wertes
einer flüssigen Probe (d + r).
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Beispiel 4 Nach diesem Beispiel wurde ein Prüfmittel zum Nachweis
von Ketonen hergestellt.
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Es wurden zwei Lösungen hergestellt der folgenden Zusammensetzung:
Lösung A Natriumnitroferricyanid H20 1,6 g Methanol 50,0 ml Wasser 50,0 ml Lösung
B Glycin 18 g Natriumphosphat 20 g Natriumbiphosphat 9 g Wasser 72 ml Das Natriumnitroferricyanid
und die Pufferreagentien sind in diesem Testsystem unverträglich. Daher wurden sie,
wie später näher angegeben, in getrennte Polymerschichten eingebracht, wobei das
zuerst genannte Reagens in einer wasserlöslichen Folie dispergiert war, die laminatartig
mit einer Phasenumkehrmatrix, enthaltend das zuletzt genannte Reagens, zusammengebracht
worden war.
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20 ml der Lösung A wurden mit 0,5 g Natriumcarboxymethylcellulose
(7-M der Hercules Inc., Wilmington, Delaware) vermischt. Die entstehende Lösung
wurde in einer Dicke von
0,25 mm auf eine Glasplatte mit Hilfe
eines Gardner-Spachtel aufgebracht und bei Raumbedingungen getrocknet.
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Die entstehende wasserlösliche Folie wurde von dem Glassubstrat abgezogen.
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7,5 ml der Lösung B wurden mit 7,5 ml Methanol und 20,0 ml einer 15%gen
(Gew./Gew.) Acetonlösung von Äthylcellulose (G-50 der Hercules Inc., Wilmington,Delaware)
vermischt.
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Die entstehende klare Lösung wurde in einer Dicke von 1,27 mm mit
Hilfe eines Gardner-Spachtels auf eine Glasplatte aufgebracht und bei Raumbedingungen
getrocknet.
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Nachdem kein Aceton mehr zu riechen war,das aus der trocknenden Lösung
kam, wurde die vorher hergestellte wasserlösliche Folie auf die feuchte Oberfläche
der entstehenden Phasenumkehrmatrix aufgebracht. Die entstehende Laminatstruktur
wurde vollständig getrocknet, in Quadrate von ungefähr 12,7 mm geschnitten und mit
Hilfe eines doppelseitigen Klebebandes mit der wasserlöslichen Seite zu dem Streifen
hin auf Sunststoffstreifen aufgeklebt.
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Die das Laminat enthaltenden Teile von vier der entstehenden Teststreifen
wurden jeweils augenblicklich in eine von vier Urinproben getaucht, enthaltend verschiedene
bekannte Konzentrationen des Ketons Acetessigsäure. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:
etonkonzentration Farbreaktion mg/100 ml 0 lederfarben 15 purpur-lederfarben 40
hel lpurpur 80 tiefpurpur
So konnte gezeigt werden, daß das erfindungsgemäße
Prüfmittel geeignet ist zum Nachweis von Ketonen in Flüssigkeiten. (d + r) Beispiel
5 In diesem Beispiel wurde ein Prüfmittel hergestellt zum Nachweis von Nitrit.
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Es wurden zwei Lösungen der folgenden Zusammensetzung hergestellt:
Lösung A p-Arsanilsäure 0,2 g Methanol 25 ml Wasser 25 ml Lösung B N-(1-Naphthyl)äthylendiamin
HCl 0,1 g Methanol 49,0 ml d-Weinsäure 0,5 g 10 ml eines Gemisches aus gleichem
Volumina der Lösungen A und B wurden mit 15 ml einer 10G/öigen (Gew./Gew.) Lösung
von Äthylcellulose (T-50 der Hercules, j:nc Wilmington, Delaware) in Aceton vermischt.
Die entstehende klare Lösung wurde entsprechend Beispiel 1 auf Glasplatten gegossen,
getrocknet, in Stücke geschnitten und auf Kunststoff streifen befestigt. Der Teil
von fünf Teststreifen, der das Reagenskissen enthielt, wurde jeweils kurz in eine
von fünf Urinproben getaucht, enthaltend verschiedene bekannte Nitritkonzentrationen.
Man erhielt die folgenden Ergebnisse:
Nitritkonzentration Farbreaktion
mg/100 ml 0,0 cremefarben 0,5 hellro sa 1,0 mittelrosa 5,0 mittelpurpur 10,0 purpur-violett
So konnte gezeigt werden, daß die erfindungsgemäßen Prüfmittel geeignet sind zum
Nachweis von nitritbildenden Mikroorganismen in einer flüssigen Probe mit Hilfe
des dip-and-read- Verfahrens.
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Beispiel 6 In diesem Beispiel wurde ein Prüfmittel hergestellt zur
Bestimmung von Nitrit,wobei die polymere Reagensträgermatrix ein nicht hydrophiles
Polymer enthielt.
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Lösungen A und B wurden entsprechend Beispiel 5 hergestellt.
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1,5 ml eines Gemisches aus gleichen Volumina der Lösungen A und B
wurden dann mit 9,0 ml einer 1obigen (Gew./Gew.) Lösung von Polyvinylchlorid (Nr.
133-4 der Dow Chemical Company, Midland, Michigan) in Hydrofuran vermischt, zu der
dann 3,0 ml einer 21%gen (Gew./Gew.) Lösung von einem äthoxylierten Nonylphenolnetzmittel
(Renex 698 der Atlas Chemical Industries, Wilmington, Delaware) in Chloroform gegeben
wurden. Die entstehende klare Lösung wurde entsprechend Beispiel 1 auf Glasplatten
gegossen, getrocknet, in Stücke geschnitten und auf Kunststoffstreifen befestigt.
Der Anteil mit dem Reagenskissen von drei der entstehenden Teststreifen wurde jeweils
eine Zeit von weniger als 30 s in eine von drei wäßrigen
Lösungen
getaucht, enthaltend verschiedene bekannte Nitritkonzentrationen. Man erhielt die
folgenden Ergebnisse: Nitritkonzentration Farbreaktion mg/100 ml 0,0 cremefarben
2,5 hellrosa 5,0 rosa So konnte gezeigt werden, daß ein erfindungsgemäßes Prüfmittel,
dessen Reagensträgermatrix ein nicht-hydrophiles Polymer enthält, geeignet ist zur
Untersuchung einer wäßrigen Probe nach dem dip-and-read-Verfahren, wenn die Reagensmatrix
zusätzlich ein Netzmittel enthält.
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Beispiel 7 In diesem Beispiel wurde ein Prüfmittel zur Bestimmung
des pH-Wertes einer wäßrigen Lösung hergestellt, wobei die Reagensträgermatrix ein
nicht-hydrophiles Polymer enthielt und aus einer nicht wäßrigen Lösung hergestellt
wurde.
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Es wurde eine erste Lösung hergestellt der folgenden Zusammensetzung:
Methyl-Rot 13 mg Bromthymol-Blau 250 mg Äthanol 1000 ml Zu 3,6 ml dieser ersten
Lösung wurden 3,0 ml einer 216Doigen (Gew./Gew.) Lösung eines äthoxylierten Nonylphenolnetzmittels
(Renex 698 der Atlas Chemical Industries, Wilmington, Delaware) in Chloroform und
9,0 ml einer
10Q/Oigen (Gew./Gew.) Polyvinylchloridlösung (Nr.
133-4 der Dow Chemical Company, lvfidland, Michigan) in Tetrahydrofuran zugegeben.
Die entstehende klare Lösung wurde entsprechend Beispiel 1 auf Glasplatten gegossen,
getrocknet, in Stücke geschnitten und auf Kunststoffstreifen befestigt. Die das
Reagens enthaltenden Teile von vier der entstehenden eststreifen wurden jeweils
eine Zeit von weniger als 30 s in eine von vier wäßrigen Lösungen getaucht, die
die verschiedenen bekannten pH-Werte ergaben. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:
pH Farbreaktion 9,4 gelb 11,0 blau-grün 12,0 blau So konnte gezeigt werden, daß
ein geeignetes Prüfmittel vom dip-and-read-Typ zur Bestimmung des pH-Wertes wäßriger
Flüssigkeiten hergestellt werden kann, wenn die Reagensträgermatrix ein nicht hydrophiles
Polymer enthält und aus einer nicht wäßrigen Lösung hergestellt wird.
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B e i s p ie 1 8 In diesem Beispiel wurde ein Prüfmittel zur Bestimmung
von Glucose in einer Probe von ganzem Blut hergestellt.
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Es wurden Prüfmittel entsprechend Beispiel 1 hergestellt.
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Der das Reagenskissen enthaltende Teil von sechs der erhaltenen rGesUstreifen
wurde momentan in Wasser getaucht. Die Teststreifen wurden dann flach mit dem rehydratisierten
Reagenskissen nach oben hingelegt. Es wurden sechs Blutproben mit verschiedenen
bekannten
Glucosekonzentrationen hergestellt. Ein Tropfen jeder
Blutprobe wurde auf eines der rehydratisierten Reagenskissen aufgebracht. Nach 30
s wurden die Blutproben von den Reagenskissen mit Wasser abgewaschen. Nach dem Abwaschen
waren keine roten Blutzellen mehr auf der Oberseite der Reagenskissen. Die auftretenden
Farbreaktionen waren identisch mit den im Beispiel 1 angegebenen.
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Es konnte gezeigt werden, daß die erfindungsgemäßen Prüfmittel geeignet
sind zur Bestimmung eines Bestandteils von ganzem Blut.
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Beispiel 9 In diesem Beispiel wurde ein Prüfmittel zur Bestimmung
von Glucose in einer Probe von ganzem Blut hergestellt.
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Es wurde eine erste Lösung hergestellt der folgenden Zusammensetzung:
Glucose-oxidase (4000 Einheiten/ml) 4,0 ml Peroxidase (3000 Einheiten/mg) 0,289
g 2,7-Diaminofluoren- 2HCl 0,277 g Ascorbinsäure 0,020 g ris-malonat-Puffer (pH
7,0) 10,0 ml Äthanol 30,0 ml Wasser 13,0 ml 2 ml der angegebenen ersten Lösung wurden
dann mit 1,0 ml Wasser, 10,0 ml einer 106/obigen (Gew./Gew.) Lösung von Äthylcellulose
(G-50 der Hercules, Inc., Wilmington, Delaware) in Aceton und 1,0 g eines antistatischen
Mittels (AL 15 der Argus Chemical Co,, Brooklyn, New York) vermischt. Die entstehende
Lösung wurde entsprechend
Beispiel 1 auf Glasplatten gegossen,
getrocknet, in Stücke geschnitten und auf Kunststoffstreifen befestigt. Der das
Reagenskissen enthaltende Anteil von sechs der entstehenden Teststreifen wurde jeweils
augenblicklich in eine von sechs Proben von ganzem Blut, enthaltend verschiedene
bekannte Konzentrationen an Glucose eingetaucht. Die auftretende Farbreaktion war
ähnlich wie diejenigein Beispiel 1.
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So konnte gezeigt werden, daß, wenn das Reagensgemisdd für ein erfindungsgemäßes
Prüfmittel ein antistatisches Mittel enthält, das entstehende Prüfmittel im ganzen
Blut nach dem dip-and-read-verfahren angewandt werden kann.
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B e i 5 p i e 1 10 In diesem Beispiel wurde ein Prüfmittel zum Nachweis
von Nitrit durch anschließendes Imprägnieren hergestellt.
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Es wurde eine erste Lösung hergestellt der folgenden Zusammensetzung:
10 % Celluloseacetat* in Aceton 20 ml Wasser 8,5 ml * Visc 45 der Eastman Kodak
Co., Rochester, New York Die entstehende Lösung wurde in einer Dicke von 1,2 mm
mit Hilfe eines Gardner-Spachtels auf eine Glasplatte aufgebracht und bei 760C getrocknet.
Die entstehende Phasenumkehrpolymermatrix wurde von der Glasplatte abgelöst und
nacheinander in die folgenden Lösungen A und B getaucht:
Lösung
A 2 % Gantrez 15 ml Arsanilsäure 75 mg Malonsäure 1,8 g Natriumlaurylsulfat 450
mg Methanol 45 ml Lösung B Polyvinylpyrrolidon/Vinyl- 3,7 ml acetat-Copolymer* Methanol
56,2 ml; N-(1-Naphthyl)-äthylen- 60 mg diamin 2HCl * E535 der Antarac Chemical Division
of GAFAC, New York Die das Reagens enthaltende Polymermatrix wurde dann bei 100C
getrocknet und in Quadrate von ungefähr 5 mm geschnitten. Diese Reagenskissen wurden
dann mit Hilfe von doppelseitigen Klebestreifen auf Kunststoffstreifen befestigt.
Der Teil der erhaltenen Teststreifen, der das- Reagenskissen enthielt, wurde jeweils
augenblicklich in eine von fünf Urinproben getaucht, enthaltend bekannte Nitritkonzentrationen.
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Man erhielt die folgenden Ergebnisse: Nitritkonzentration 2'arbreaktion
mg/100 ml 0,0 weiß 0,2 leicht rosa 0,5 mittelrosa 1,0 rosa 2,0 dunkelrosa
So
konnte gezeigt werden, daß die erfindungsgemäßen Prüfmittel zur Bestimmung von Nitrit
in einer Flüssigkeit geeignet sind, wenn sie durch nachträgliches Imprägnieren hergestellt
worden sind.
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B e i s p i e l 11 In diesem Beispiel wurde ein Prüfmittel zum Nachweis
von Bilirubin durch ein nachträgliches Imprägnierverfahren hergestellt.
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Es wurde eine erste Lösung hergestellt der folgenden Zusammensetzung:
15 % Celluloseacetat* in Aceton 18 g 15 u,Ó Tributoxyäthylphosphat in Aceton 2 g
Styrolmaleinsäureanhydrid 1 ml Toluol 3 ml Methanol 4,5 ml Wasser 4,5 ml *Visc 45
der Eastman Kodak Co., Rochester, New York Die entstehende Polymerlösung wurde auf
Polystyrolkunststoffstreifen in einer Dicke von 1,27 mm aufgebracht und bei ungefähr
70°C getrocknet. Die entstehende Struktur, bestehend aus einer Phasenumkehrpolymermatrix
die mit einer Polystyrolfolie verschmolzen war, wurde in die folgende Reagenslösung
getaucht: Sulfosalicylsäure 9,8 g Coffein 14,0 g 1,5-Naphthylen-disulfonsäure 0,84
g 2,4-Dichloranilin 0,105 g 10 % Gantrez 14 m Natriumnitrit 9,14 g Wasser 126 ml
Die
das Reagens enthaltende Polymermatrix-Polystyrolfolien-Struktur wurde bei 700C getrocknet
und dann zu Reagenskissenquadraten in einer Größe von ungefähr 5 mm geschnitten
und die Reagenskissen mit der Polystyrolseite zu dem Kunststoffstreifenbin mit Hilfe
von doppelseitigen Klebestreifen auf dem Kunststoffstreifen befestigt. Der das Reagenskissen
enthaltende Teil von zwei der entstehenden Teststreifen wurde jeweils augenblicklich
in eine von zwei Urinproben getaucht, enthaltend bestimmte Konzentrationen von Bilirubin.
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Man erhielt die folgenden Ergebnisse: Bilirubin-Konzentrati on Farbreaktion
mg/100 ml 0 weiß 1,6 rosa So konnte gezeigt werden, daß ein erfindungsgemäßes Prüfmittel,
das durch nachträgliches Imprägnieren der Matrix erhalten worden ist, geeignet ist
zum Nachweis von Bilirubin in einer Flüssigkeit.
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B e i 5 D i e 1 12 In diesem Beispiel wurde ein Prüfmittel zum nachweis
von Ketonen hergestellt.
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Es wurde ein Gemisch der folgenden Zusammensetzung hergestellt: äthoxylierter
Fettalkohol* 80 g Natriumlaurylsulfat 14 g Glycin 44 g Natriumnitroferricyanid 14
g Natriumphosphat 12 H20 17,5 g
Natriumbiphosphat 5,6 g Amylalkohol
20 ml *BIO-SOLF EA-10 der Stephan Chemical Co., Northfield, Illinois Das entstehende
Gemisch wurde 15 bis 18 h in einer Kugelmühle gestürzt (vermahlen) und dann 11 g
des Gemisches mit der folgenden Lösung vermischt: 15 % Celluloseacetat* und 1,5
% Tributoxyäthylphosphat in 5,6 % Methylenchlorid/94,4 k Dioxan 20 g -Amylalkohol
3 ml * Visc 45 der Eastman Kodak Co., Rochester, New York.
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Die entstehende Dispersion von Reagentien in der Polymerlösung wurde
mit Hilfe eines Gardner-Spachtels in einer Dicke von 0,64 mm auf einen Polystyrolkunststoffstreifen
aufgebracht und bei Raumtemperatur getrocknet. Die entstehende Struktur, die aus
der das Reagens enthaltenden Phasenumkehrpolymermatrix, die mit der Polystyrol folie
verschmolzen war, bestand, wurde in quadratische Reagenskissen von ungefähr 5 mm
geschnitten und die Kissen mit der Polystyrolseite zu dem Kunststoffstreifen hin
mit Hilfe doppelseitiger Klebestreifen auf Kunststoffstreifen aufgeklebt. Der das
Reagenskissen enthaltende Teil von zwei der entstehenden Teststreifen wurde jeweils
augenblicklich in eine von zwei Urinproben getaucht, von denen die eine keine-Ketonkörper
und die andere 2 o Natriumacetoacetat enthielt.
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Bei dem Reagenskissen, das in die Urinprobe, enthaltend Acetoacetat
getaucht wurde, war eine deutliche Farbänderung zu beobachten.
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Es konnte so gezeigt werden, daß die erfindungsgemäßen
Prüfmittel
zum Nachweis von Ketonen in einer Flüssigkeit geeignet sind, wenn sie mit Hilfe
eines in situ-Verfahrens hergestellt worden sind, bei denen das Testreagens in dem
Polymer-'lösungsmittel--System in Form einer Dispersion oder Suspension vorhanden
ist.
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PATENTANSPRÜCHE: