DE19858892A1

DE19858892A1 - Kontinuierliches Verfahren zur Trennung von Stoffen nach Molekülgröße

Info

Publication number: DE19858892A1
Application number: DE19858892A
Authority: DE
Inventors: Lothar Britsch; Michael Schulte; Jochen Stube
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1998-12-19
Filing date: 1998-12-19
Publication date: 2000-06-21
Also published as: EP1140316B1; CZ20012183A3; ATE307649T1; JP2002532730A; EP1140316A1; US6551512B1; WO2000037156A1; DE59912722D1

Abstract

Kontinuierliche Trennverfahren, insbesondere unter Verwendung von SMB-Verfahren, werden offenbart, wobei die Analyte durch Size Exclusion Chromatographie (Gelpermeationschromatographie) getrennt werden.

Description

Die Erfindung betrifft die Übertragung von chromatographischen Trenn verfahren nach dem Size Exclusion Prinzip (Size Exclusion Chromato graphy; SEC) auf kontinuierliche Chromatographieverfahren, insbesondere auf die simulierte Gegenstrom-Chromatographie (Simulated Moving Bed (SMB) Chromatographie).

Die Trennung von Stoffen, insbesondere Makromolekülen, nach Molekül größe ist ein verbreitetes chromatographisches Trennprinzip. Besonders in der Aufreinigung von Peptiden und Proteinen werden Verfahren wie die Size Exclusion Chromatographie (SEC), häufig auch Gelpermeations chromatographie genannt, im großem Umfang eingesetzt. So werden beispielsweise in dem Übersichtsartikel von G. Subramanian, Process scale liquid chromatography (VCH Weinheim 1995) präparative Anwendun gen dieser Trennmethode dargestellt. Alle diese Anwendungen beruhen jedoch auf batch-Verfahren, die sich durch eine schlechte Raum-Zeit- Ausbeute auszeichnen. Die Ursache liegt zum einen in den langen Retentionszeiten der Komponenten, die eine große Zykluszeit (Zeit zwischen zwei Injektionen) bedingen. Da die meisten in der SEC eingesetzten Materialien nur eine geringe Druckstabilität aufweisen, können die Flußraten nicht erhöht werden, um eine schnellere Trennung zu erzielen. Zudem weisen die meisten Trägermaterialien eine schlechte Beladbarkeit auf (< 5% des Gelvolumens). Manche dieser Probleme liessen sich durch die Anwendung kontinuierlicher Verfahren verbessern. Es ist bisher jedoch nicht möglich, diese SEC-Trennverfahren auf konti nuierliche Verfahrensweisen anzuwenden; die Parameter für ein derartiges kontinuierliches Trennverfahren müßten durch geeignete Modellrechnun gen bestimmt werden. Außerdem müssen die erhaltenen Prozeßpara meter einen stabilen kontinuierlichen Betrieb erlauben.

Kontinuierliche chromatographische Verfahren, wie z. B. die Simulated Moving Bed (SMB)- Chromatographie werden traditionell im großen Maßstab in der petrochemischen und der Zuckerindustrie eingesetzt. Mittlerweile finden diese Verfahren jedoch auch in der feinchemischen und pharmazeutischen Industrie Anwendung, hauptsächlich zur Trennung von Isomeren und Enantiomeren, d. h. bei Trennproblemen von klassischen Zweistoffgemischen. Erste Versuche zur Isolierung von Komponenten aus Mehrstoffgemischen wurden ebenfalls beschrieben.

Um geeignete Prozeßparameter für die SMB-Chromatographie zu gewin nen, wurden mehrere Simulationsmodelle entwickelt, von denen das rigo rose SMB-Prozeßmodell den weitreichensten Ansatz aufweist. Simula tionsansätze sind beispielsweise von Nicoud et al. (Nancy, 1993) und in WO 97/34 918 offenbart. Gemeinsam ist diesen Verfahren, daß für die Analyte Adsorptionsisotherme ermittelt werden; diese Meßergebnisse sind dann die Grundlage der Modellrechnungen. Bei Weiterentwicklungen aus jüngerer Zeit wurden auf der Grundlage des True Counter Current Modells Trennungen von binären Mischungen im Modell dargestellt: G. Storti et al. (1993) AlChE Journal 39, Seiten 471-472 und von E. Francotte et al. (1998) J. Chromatogr. A 796, Seiten 239-248. Bei einer weiteren Ent wicklung werden ausgehend von einem ersten Parametersatz unter Anwendung von detailierter Prozeßsimulation die Parameter optimiert: J. Strube, U. Altenhöner, M. Meurer und H. Schmidt-Traub (1997) Chem.-Ing. Tech. 69, Seiten 328-331, sowie Dissertation J. Strube (Universität Dortmund, 1996). Alle diese Modelle beruhen jedoch auf der Bestimmung von Adsorptionsisothermen.

Während bisher für SMB-Verfahren angewandte chromatographische Trennverfahren, beispielsweise die Enantiomerentrennung oder die Ionenaustauschchromatographie, auf adsorptiven Vorgängen beruht, beruht die SEC auf einem gänzlich anderen Prinzip: Für Analyte unter schiedlicher Molekülgröße stehen wegen der Porengrößenverteilung im Sorbens unterschiedliche Volumina zur Verteilung offen; somit eluieren größere Moleküle früher als kleinere. Die SEC beruht also auf einem diffusiven Mechanismus unter Einschluß eines Größenausschluß mechanismus, eine Adsorption der Analyte an das Sorbens findet nicht statt. Phasengleichgewichte wie bei der Adsorptionschromatographie liegen folglich nicht vor. Somit sind die bisher bekannten Modellierungs verfahren, die die Parameter für die SMB-Chromatographie liefern, für die SEC nicht anwendbar. Insbesondere tritt das Problem auf, die Raffinatfront der am kürzesten retinierten Komponente im Bereich der Sektion IV, d. h. zwischen Raffinat- und Eluentenleitung, zu stabilisieren. Dieses Problem wird weiter verstärkt, da bei vielen SEC Trennverfahren ein Teil der Analyte im Ausschlußvolumen (void volume) eluiert. Solche Komponenten werden durch die Zone IV transportiert und verunreinigen die Extraktkomponente. Es ist bisher unmöglich, für SEC-Trennverfahren die Prozeßparameter von batch-Rechnermodellen auf kontinuierliche Trennverfahren (z. B. SMB-Trennverfahren) zu übertragen, und somit gezielt Trennparameter für kontinuierliche Trennverfahren zu gewinnen, die einen stabilen Betrieb erlauben.

Aufgabe der Erfindung ist es also, Modelle und Verfahren zu entwickeln, die es erlauben, für SEC-Trennverfahren gezielt Trennparameter für kontinuierliche Trennverfahren zu gewinnen, die einen stabilen Betrieb erlauben.

Gegenstand der Erfindung sind kontinuierliche Trennverfahren, insbe sondere unter Verwendung von SMB-Verfahren, bei denen die Analyte durch Size Exclusion Chromatographie (Gelpermeationschromatographie) getrennt werden.

Abb. 1 zeigt die SEC-Trennung von Magermilchpulver auf einer Superformance® Säule 600 . 16 mm, gefüllt mit Fractogel® EMD BioSEC (S), die Abb. 2-4 zeigen die Chromatogramme der Einzel komponenten:

Abb. 2. Casein-Fraktion - RT 39,5; 53,92 min

Abb. 3. β-lactoglobulin A - RT 63.52 min

Abb. 4; alpha-Lactalbumin - RT 71,60 min

Abb. 5 stellt ein Elutionschromatogramm der Einzelkomponenten dar, das als Ergebnis der erfindungsgemäßen rigorose Modellierung der Einzelsubstanzen ermittelt wurde.

Abb. 6 zeigt das interne axiale Konzentrations-Profil einer SEC-SMB Anlage mit den Konzentrationen der Einzelkomponenten in den einzelnen Zonen zum Ende einer Taktzeit.

Eine theoretische Modellrechnung für einfache Stoffsysteme für SEC- Trennungen im batch-Verfahren wurde von Tien Gu beschrieben (Mathe matic Modelling of Liquid Chromatography; Springer Verlag, 1995).

Es wurde gefunden, daß stabile Prozeßparameter für die Anwendung von SEC Trennungen in SMB-Verfahren erhalten werden können, wenn man erfindungsgemäß folgendermaßen vorgeht:

a) Die Verweilzeiten der zu trennenden Substanzen in der Trennsäule und die Bandenverbreiterung der Substanzpeaks werden berechnet. Für die Berechnung der Verweilzeiten dient beispielsweise das bereits genannte von Tien Gu (1995) angegebene Verfahren.
b) Aus den Daten, die mittels (analytischer) batch-Chromatogramme erhalten werden, werden die effektiven Porositäten für jede Kompo nente und die Verweilzeiten berechnet.
c) Die Bandenverbreiterung kann beispielsweise aus den effektiven mole kularen Diffusionskoeffizienten berechnet werden. Die effektiven mole kularen Diffusionskoeffizienten können auf der Grundlage der Stokes- Einstein-Relation und den Molekulargewichten der Komponenten abgeschätzt werden.
d) Die Übereinstimmung der berechneten Daten (Schritte b) und c)) mit dem beobachteten Elutionsprofil wird überprüft und gegebenenfalls die berechneten Daten in weiteren Iterationsschritten besser an die experimentellen Daten angepaßt.
e) Aus den Parametern der angepaßten Modellrechnung werden, nach prinzipiell bekannten Verfahren, wie wie sie beispielsweise in den bereits genannten Publikationen G. Storti et al. (1993) oder Disser tation Strube (1996) angegeben sind, die notwendigen Nettoflußraten verhältnisse des SMB-Prozesse berechnet.

Durch die oben angegebene Vorgehensweise zur Berechnung von Ver weilzeit und Bandenverbreiterung und den daraus resultierenden Para metern, können die vorbekannten Modelle (G. Storti et al. (1993) oder Dissertation Strube (1996)) auch ohne Ermittlung von Adsorptionsiso thermen angewandt werden.

Das vorgeschlagene Modell erwies sich als hinreichend genau als es für verschiedene Konzentrationen und lineare Geschwindigkeiten an einer Einzelsäule überprüft wurde. Dabei wird die Verteilung der Verweilzeiten durch die Diffusionsparameter bestimmt, wie sie für die Innenvolumina der Sorbenspartikel gelten. Aus den Molekulargewichten der Komponenten werden nach der Stokes-Einstein Relation die effektiven molekularen Diffusionskoeffizienten abgeschätzt und in dem Modell als Stofftransport koeffizienten berücksichtigt.

Erfindungsgemäß können allgemein bekannte SEC-Träger verwendet werden; bevorzugt sind druckstabile SEC-Träger, die ebenfalls kommerziell angeboten werden, beispielsweise Fraktogel® EMD BioSEC, wie es in DE 43 16 136 offenbart ist.

Endungsgemäß werden SMB-Anlagen verwendet, wie sie ebenfalls kommerziell erhältlich sind. Die Trennung wird unter isokratischen Bedingungen durchgeführt und kann somit in einem Simulated Moving Bed-System automatisiert werden.

Erfindungsgemäße Trennverfahren erlaubt eine verbesserte Auftrennung von Proteinen nach Molekülgröße, da es sich in großen Anlagen kontinuier lich und vollautomatisch durchführen läßt; diese Trennverfahren sind insbesondere auf folgenden Anwendungsgebieten anwendbar:

- Die Aufreinigung von Proteinen aus Milch transgener Tiere;
- ein weiteres großvolumiges Verfahren stellt die Entsalzung von Feedgemischen dar, dessen Ökonomie durch ein kontinuierliches SEC- Verfahren verbessert wird.
- Im sogenannten Drug Targeting wird angestrebt, Arzneistoffe gezielt an den Ort der Wirkung zu befördern. Hierzu werden u. A. mit Arzneistoff beladene Liposomen eingesetzt. In der Herstellung dieser Liposomen besteht ein Problem in der Abtrennung nicht-eingeschlossenen Arzneistoffs von den beladenen Liposomen. Dies kann durch ein kontinuierliches SEC-Verfahren im großen Maßstab geleistet werden.
- Neben der Fraktionierung natürlicher Makromoleküle kann das Verfahren natürlich auch auf synthetische Polymere, z. B. Polyethylen oxide, Silicone etc., angewendet werden.
- In der Kombination mit einem Reaktivträger, wie sie in der Reaktiv-SMB eingesetzt werden, können Reaktion und Trennung in einem Schritt durchgeführt werden. Ein denkbarer Einsatzzweck ist die Abspaltung der TAG-Einheiten rekombinanter Proteine durch eine Protease und die gleichzeitige Abtrennung der TAG-Einheiten von den Zielproteinen durch SEC-SMB.
- Weiterhin sind erfindungsgemäße Verfahren geeignet, Viren aus biologischen Produkten abzureichern.

Auch ohne weitere Ausführungen wird davon ausgegangen, daß ein Fach mann die obige Beschreibung im weitesten Umfang nutzen kann. Die bevorzugten Ausführungsformen und Beispiele sind deswegen lediglich als beschreibende, keineswegs als in irgendeiner Weise limitierende Offen barung aufzufassen.

Die vollständige Offenbarung aller vor- und nachstehend aufgeführten Anmeldungen, Patente und Veröffentlichungen sind durch Bezugnahme in diese Anmeldung eingeführt.

Anwendungsbeispiel

Die Abtrennung der Casein-Fraktion aus Magermilchpulver wird beschrie ben: Für die Ermittlung der Prozeßparameter wird die Probe, sowie die wesentlichen Einzelkomponenten im batch chromatographiert:

Abb. 1 zeigt die SEC-Trennung von Magermilchpulver auf einer Superformance© Säule 600 . 16 mm, gefüllt mit Fractogel® EMD BioSEC (S), die Abb. 2-4 zeigen die Chromatogramme der Einzel komponenten:

Abb. 2 Casein-Fraktion RT 39,5; 53,92 min

Abb. 3 β-lactoglobulin A RT 63.52 min

Abb. 4 alpha-Lactalbumin RT 71,60 min

Abb. 5 stellt ein Elutionschromatogramm der Einzelkomponenten dar, das als Ergebnis der Iterationen bei der erfindungsgemäß vorgesehenen rigorosen Modellierung der Einzelsubstanzen ermittelt wurde.

Abb. 6 zeigt das interne axiale Konzentrations-Profil einer SEC-Tren nung in einer SMB Anlage mit den Konzentrationen der Einzelkomponen ten in den einzelnen Zonen zum Ende einer Taktzeit. Die Prozeßpara meter wurden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt.

Zuordnung der Komponenten:

Eine SMB-Anlage mit folgenden Parametern ist in der Lage, die Komponenten E und F (Casein) und A-D in Reinheiten < 99% zu produzieren:

Prozeßparameter

Vergleich Batch-Verfahren gegenüber erfindungemmäßem SMB- Verfahren

Ein Vergleich der Produktivitäten von Batch- und SMB-Verfahren zeigt den großen Vorteil des kontinuierlichen Gegenstromverfahrens aufgrund der wesentlich ökonomischeren Ausnutzung der stationären Phase:

Erfindungsgemäß werden im Gegensatz zu adsorptiven Trennmechanis men keine Phasengleichgewichtsisothermen beschrieben, sondern erst mals für kontinuierliche Verfahren die für die Stofftrennung nach dem SEC- Verfahren charakteristischen unterschiedlichen Diffusionsgeschwindig keiten in den Sorbenspartikeln sowie die unterschiedlichen verfügbaren Porenvolumina als Kenngrößen verwendet. Beide für die Trenneffekte von SEC-Trennverfahren charakteristischen Größen werden erstmals in dem der Erfindung zugrundeliegenden Modell realistisch berücksichtigt.

Claims

1. Kontinuierliches chromatographisches Trennverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß die Analyte durch Size Exclusion Chromatographie (Gelpermeationschromatographie) getrennt werden.

2. Trennverfahren nach Anspruch 1, wobei das kontinuierliche chroma tographische Trennverfahren ein SMB-Verfahren darstellt.