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Patents

  1. Advanced Patent Search
Publication numberDE102010062810 B4
Publication typeGrant
Application numberDE201010062810
Publication date13 Mar 2014
Filing date10 Dec 2010
Priority date7 Sep 2010
Also published asCA2811454A1, CA2811454C, CA2870626A1, CN103237802A, CN106243060A, DE102010062810A1, DE102011053114A1, EP2614060A2, EP2614060B1, EP2693216A1, EP3097914A2, EP3097914A3, US9370523, US20130184268, US20150024418, US20150374711, WO2012031941A2, WO2012031941A3
Publication number1010062810, 201010062810, DE 102010062810 B4, DE 102010062810B4, DE 2010/10062810 B4, DE-B4-102010062810, DE1010062810, DE102010062810 B4, DE102010062810B4, DE2010/10062810B4, DE201010062810
InventorsJens Pahnke
ApplicantImmungenetics Ag
Export CitationBiBTeX, EndNote, RefMan
External Links: DPMA, Espacenet
2-(R2-Thio)-10-[3-(4-R1-piperazin-1-yl)propyl]-10H-phenothiazine zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen ausgewählt aus beta-Amyloidopathien und alpha-Synucleinopathien 2- (R2-thio) -10- [3- (4-R1-piperazin-1-yl) propyl] -10H-phenothiazine for the treatment of neurodegenerative diseases selected from beta-Amyloidopathien and alpha-synucleinopathies translated from German
DE 102010062810 B4
Abstract  translated from German
Die Erfindung betrifft 2-(Ethyl-thio)-10-[3-(4-methyl-piperazin-1-yl)propyl]-1 OH-phenothiazin gemäß der allgemeinen Formel I The invention relates to 2- (ethyl-thio) -10- [3- (4-methyl-piperazin-1-yl) propyl] -1 OH-phenothiazine of the general formula I
Figure DE102010062810B4_0001
zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen, ausgewählt aus β-Amyloldopathlen und α-Synucleinopathien. for the treatment of neurodegenerative diseases selected from β-α-synucleinopathies and Amyloldopathlen.
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Claims(4)  translated from German
  1. 2-(R 2 -Thio)-10-[3-(4-R 1 -piperazin-1-yl)propyl]-10H-phenothiazin gemäß der allgemeinen Formel I 2- (R 2 -thio) -10- [3- (4-R 1 -piperazine-1-yl) propyl] -10H-phenothiazine of the general formula I
    Figure DE102010062810B4_0005
    wobei der Rest R 1 eine Methylgruppe, der Rest R 2 eine Ethylgruppe und die Reste R 3 und R 7 Wasserstoff sind zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen ausgewählt aus beta-Amyloidopathien und alpha-Synucleinopathien. wherein R 1 is a methyl group, the radical R 2 is an ethyl group and the radicals R 3 and R 7 is hydrogen are useful for treating neurodegenerative diseases selected from beta-Amyloidopathien and alpha-synucleinopathies.
  2. 2-(Ethyl-thio)-10-[3-(4-methyl-piperazin-1-yl)propyl]-10H-phenothiazin zur Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass weitere Wirkstoffe, vorzugsweise 1-Benzhydrylpiperazine, höchst bevorzugt 1-Benzhydryl-4-cinnamylpiperazin, zugesetzt werden. 2- (ethyl-thio) -10- [3- (4-methyl-piperazin-1-yl) propyl] -10H-phenothiazine for use according to claim 1, characterized in that further active ingredients, preferably 1-benzhydrylpiperazine, most preferably 1-benzhydryl-4-cinnamylpiperazin be added.
  3. 2-(Ethyl-thio)-10-[3-(4-methyl-piperazin-1-yl)propyl]-10H-phenothiazin zur Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die beta-Amyloidopathie eine Alzheimer Demenz ist. 2- (ethyl-thio) -10- [3- (4-methyl-piperazin-1-yl) propyl] -10H-phenothiazine for use according to any one of claims 1 or 2, characterized in that the beta-Alzheimer Amyloidopathie Dementia is.
  4. 2-(Ethyl-thio)-10-[3-(4-methyl-piperazin-1-yl)propyl]-10H-phenothiazin zur Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die alpha-Synucleinopathie eine Parkinson'sche Erkrankung oder eine Lewy-Körperchen-Demenz ist. 2- (ethyl-thio) -10- [3- (4-methyl-piperazin-1-yl) propyl] -10H-phenothiazine for use according to any one of claims 1 or 2, characterized in that the alpha-Parkinson Synucleinopathie 's disease or Lewy body dementia.
Description  translated from German
  • [0001] [0001]
    Die Akkumulation von Proteinen oder Proteinfragmenten (Peptiden) im Gehirn ist ein signifikantes Merkmal von altersabhängigen neurodegenerativen Erkrankungen. The accumulation of proteins or protein fragments (peptides) in the brain is a significant feature of age-related neurodegenerative diseases. Bei der Alzheimer Demenz (Alzheimer disease, AD) und der zerebralen β-Amyloidangiopathie (CAA) ist die Aggregation von β-Amyloid-Peptiden (Aβ) krankheitsauslösend, wobei der zugrunde liegende Mechanismus nicht bekannt ist. In Alzheimer dementia (Alzheimer's disease, AD) and cerebral amyloid angiopathy-β (CAA), the aggregation of β-amyloid peptides (Aβ) is disease-inducing, the underlying mechanism is not known. Die Aβ-Proteostase, dh das Gleichgewicht von Produktion und Abbau/Abtransport mittels Rezeptoren oder Proteasen, ist bei der AD und CAA gestört. The Aβ-proteostasis, ie the balance between production and degradation / dissipation via receptors or proteases is disturbed in AD and CAA. Der Entfernung der Aβ-Peptide durch zelluläre Transporter (ABC Transporter) wurde jedoch bisher wenig Beachtung beigemessen. The removal of Aβ peptides by cellular transporters (ABC transporters) has heretofore been given little attention.
  • [0002] [0002]
    Generell sind neurodegenerative Erkrankungen und deren Behandlung ein vielbeachtetes Thema. Generally, neurodegenerative diseases and their treatment is a hot topic. So werden in der Thus, in the WO 2008/133884 A2 WO 2008/133884 A2 die verschiedensten Erkrankungen genannt, zu deren Behandlung eine breite Palette an unterschiedlichsten Wirkstoffen mit differenten Wirkmechanismen angeführt wird. called a variety of diseases, their treatment led to a wide range of diverse agents has different mechanisms of action. Lorenzen et al. Lorenzen et al. (S. Lorenzen; M. Dunkel; R. Preissner, BioSystems 80(2), 2005, 117–122) thematisieren die Behandlung der transmissiblen spongiformen Enzephalopathie, bei welcher es sich um eine übertragbare Hirnerkrankung handelt, bei der es zu einer schwammartigen Veränderung des Gehirngewebes kommt. (S. Lorenzen, M. darkness; R. Preissner, BioSystems 80 (2), 2005, 117-122) address the treatment of transmissible spongiform encephalopathy, wherein it is a transmissible brain disease in which a spongy change it of brain tissue occurs. In der In the WO 96/004915 A1 WO 96/004915 A1 wird die Behandlung von Alzheimer mit Phenothiazinen und Thioxanthenen vorgestellt. the treatment of Alzheimer's disease is presented with phenothiazines and thioxanthenes. Die The DE 44 30 091 A1 DE 44 30 091 A1 bezieht sich auf die Behandlung zerebraler Erkrankungen. refers to the treatment of cerebral diseases.
  • [0003] [0003]
    Mittels verschiedener gentechnisch veränderter Mausmodelle konnte gezeigt werden, dass der ATP-Transporter (gemeinsames Strukturelement der ATP-Transporter ist eine ATP-bindende Kassette) ABCC1, welcher im Plexus choroideus besonders stark exprimiert wird, ein wichtiger Aβ-Transporter ist, der außergewöhnliche funktionelle Auswirkungen auf die zerebrale Aβ-Akkumulation hat. Using various genetically modified mouse models has been shown that the ATP transporter (common structural element of the ATP transporter is an ATP-binding cassette) ABCC1, which in the choroid plexus is highly expressed, an important Aβ transporter is the extraordinary functional consequences has on cerebral Aβ accumulation.
  • [0004] [0004]
    Zur Bestimmung der ABCC1-Aktivität in vivo wurde bei APP-exprimierenden, transgenen Mäusen jeweils der ABCB1-, der ABCG2- oder der ABCC1-Transporter gentechnisch entfernt (knock out Mäuse). To determine the ABCC1 activity in vivo in each of ABCB1, the ABCG2- or ABCC1 transporter was in APP-expressing transgenic mice genetically removed (knock out mice).
  • [0005] [0005]
    Dabei wurde gefunden, dass: It was found that:
    • i) die Menge von Aß in den Mäusen, denen der ABCC1 Transporter fehlte, um das 12-fache gesteigert war, i) the amount of Aß in mice lacking the transporter ABCC1 order was increased 12-fold,
    • ii) der ABCB1-Transporterverlust nur zu einer 3-fachen Erhöhung führt und ii) the ABCB1 transporter loss leads to only a 3-fold increase and
    • iii) der ABCG2-Verlust keine Aβ-akkumulierende Auswirkung hat. iii) the ABCG2-loss has no Aβ-accumulative effect.
  • [0006] [0006]
    Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, Substanzen bereit zu stellen, welche den ABCC1-Transporter in geeigneter Weise beeinflussen, um so neurodegenerative Erkrankungen behandeln zu können. Object of the present invention is therefore to provide substances which affect the ABCC1 transporter in an appropriate way to treat neurodegenerative diseases can. Diese Aufgabe wurde mit 2-(Ethyl-Thio)-10-[3-(4-Methyl-piperazin-1-yl)propyl]-1OH-phenothiazin gemäß Anspruch 1 gelöst. This object is achieved with 2- (ethyl thio) -10- [3- (4-methyl-piperazin-1-yl) propyl] phenothiazine -1OH according to claim 1. Weitere bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen. Further preferred embodiments will be apparent from the dependent claims.
  • [0007] [0007]
    In anderen Worten wurde die Aufgabe durch 2-(R 2 -Thio)-10-[3-(4-R 1 -piperazin-1-yl)propyl]-10H-phenothiazin gemäß der allgemeinen Formel 1 gelöst, In other words, the object is achieved by 2- (R 2 -thio) -10- [3- (4-R 1 -piperazine-1-yl) propyl] -10H-phenothiazine was achieved according to the general formula 1,
    Figure DE102010062810B4_0003
    wobei der Rest R 1 eine Methylgruppe, der Rest R 2 eine Ethylgruppe und die Reste R 3 und R 7 Wasserstoff sind (Thiethylperazin, Torecan ® ) zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen ausgewählt aus beta-Amyloidopathien und α-Synucleinopathien. wherein R 1 is a methyl group, the radical R 2 is an ethyl group and the radicals R 3 and R 7 are hydrogen (thiethylperazine, Torecan ®) for the treatment of neurodegenerative diseases selected from beta-Amyloidopathien and α-synucleinopathies.
  • [0008] [0008]
    Diese Substanz Thiethylperazin ist ausgewählt aus Verbindungen der allgemeinen Formel I, von denen die restlichen Vertreter nicht im Schutzbereich der Patentansprüche liegen, This substance thiethylperazine is selected from compounds of the general formula I, of which the remaining representatives are not within the scope of the claims,
    wobei die Reste where the radicals
    R 1 und R 2 gleich oder verschieden sind und jeweils unabhängig voneinander C 1 -C 6 -Alkylgruppen sind, welche unabhängig voneinander gegebenenfalls einen weiteren Substituenten ausgewählt aus Alkyl-, Aryl-, Acyl-, Acetyl-, Amino-, Nitro-, Sulfonyl-, Hydroxyl-, Alkoxy-, Aryloxy-, Arylthio-, Alkylthio-Gruppe und Halogenatom aufweisen, wobei die jeweiligen Alkylgruppen gegebenenfalls mindestens ein weiteres Halogenatom aufweisen und der Rest R 1 and R 2 are identical or different and are each independently C 1 -C 6 alkyl groups, which are independently optionally a further substituent selected from alkyl, aryl, acyl, acetyl, amino, nitro, sulfonyl -, hydroxy, alkoxy, aryloxy, arylthio, alkylthio group and halogen atom have, wherein the respective alkyl groups optionally having at least one additional halogen atom and the remainder
    R 3 sich an einer der Positionen 6–9 des Phenothiazin-Ringsystems befindet und ein Wasserstoffatom oder eine Alkyl-, Aryl-, Acyl-, Acetyl-, Amino-, Nitro-, Sulfonyl-, Hydroxyl-, Alkoxy-, Aryloxy-, Arylthio- oder Alkylthio-Gruppe oder ein Halogenatom ist, wobei die jeweiligen Alkylgruppen gegebenenfalls mindestens ein weiteres Halogenatom aufweisen, oder eine NR 4 R 5 - oder OR 6 -Gruppe ist, wobei R 4 , R 5 und R 6 gleich oder verschieden sind und jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff und C 1 -C 3 -Alkylgruppe und der Rest R 3 is located at any of positions 6-9 of the phenothiazine ring system and represents a hydrogen atom or an alkyl, aryl, acyl, acetyl, amino, nitro, sulfonyl, hydroxyl, alkoxy, aryloxy, arylthio or alkylthio group or a halogen atom, wherein the respective alkyl groups optionally having at least one additional halogen atom, or an NR 4 R 5 -, or OR 6 group, wherein R 4, R 5 and R 6 are identical or different and are each independently selected from hydrogen and C 1 -C 3 alkyl group and the rest
    R 7 sich an einer der Positionen 1, 2 oder 4 des Phenothiazin-Ringsystems befindet und ein Wasserstoffatom oder eine Alkyl-, Aryl-, Acyl-, Acetyl-, Amino-, Nitro-, Sulfonyl-, Hydroxyl-, Alkoxy-, Aryloxy-, Arylthio- oder Alkylthio-Gruppe oder ein Halogenatom ist, wobei die jeweiligen Alkylgruppen gegebenenfalls mindestens ein weiteres Halogenatom aufweisen, oder eine NR 8 R 9 - oder OR 10 -Gruppe ist, wobei R 8 , R 9 und R 10 gleich oder verschieden sind und jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff und C 1 -C 3 -Alkylgruppe. R 7 is at one of the positions 1, 2 or 4 of the phenothiazine ring system and represents a hydrogen atom or an alkyl, aryl, acyl, acetyl, amino, nitro, sulfonyl, hydroxyl, alkoxy, aryloxy -, arylthio or alkylthio group or a halogen atom, wherein the respective alkyl groups optionally having at least one additional halogen atom, or an NR 8 R 9 -, or OR 10 group, wherein R 8, R 9 and R 10 are identical or different and are each independently selected from hydrogen and C 1 -C 3 alkyl group.
  • [0009] [0009]
    Sowohl die Mausmodelle als auch die pharmakologische Beeinflussung des ABCC1 zeigen, dass dieser ein wichtiger zellulärer Transmembrantransporter für das Aβ-Protein ist und implizieren, dass der Plexus choroideus eine Schlüsselposition für die Aβ-Ausscheidung aus dem Gehirn einnimmt. Both the mouse models as well as the pharmacological manipulation of ABCC1 show that this is an important cellular transmembrane transporter for the Aβ protein, implying that the choroid plexus a key position for the Aβ secretion takes from the brain. Es konnte gezeigt werden, dass die selektive pharmakologische Aktivierung des ABCC1-Transporters die zerebrale Belastung mit Aβ signifikant verringert und so therapeutisch zur Behandlung von Erkrankungen mit gestörter Proteostase verwendbar ist. It was shown that the selective pharmacological activation of ABCC1 transporter cerebral stress significantly reduced with Aβ and so therapeutically useful for the treatment of diseases with disturbed proteostasis.
  • [0010] [0010]
    Veränderungen von Exportmechanismen, welche in Zusammenhang mit ABC-Transportern stehen, können das temporale Aggregationsprofil von Aß und anderen Hirnproteinen substantiell beeinflussen. Changes in export mechanisms, which are associated with ABC transporters may affect the temporal aggregation profile of Aß and other brain proteins substantially. Demzufolge wirkt sich eine Beeinflussung der Funktion des ABCC1-Transporters auf das Risiko an neurodegenerativen Erkrankungen, insbesondere an Alzheimer, zu erkranken positiv aus. As a result, acts to influence the function of the ABCC1 transporter on the risk of neurodegenerative diseases, in particular to developing Alzheimer's disease, a positive effect. „Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen” umfasst in diesem Sinne die Prophylaxe als auch die Behandlung bereits bestehender Erkrankungen. "Treatment of neurodegenerative diseases" in this sense, the prophylaxis and treatment of existing diseases.
  • [0011] [0011]
    Die Rolle der ABC-Transporter bei der Aβ-Ausscheidung wurde zuerst derart untersucht, dass nachgewiesen wurde, dass ABCC1 in der Lage ist, Aß zu transportieren. The role of ABC transporters in Aβ secretion was first studied in such a way that it has been demonstrated that ABCC1 is able to transport Ass. Hierzu wurden in vitro Transwell-Assays mit Endothelzellen (endothelial cell transwell assay, ECTA) von primären, kultivierten, Kapillarendothelzellen aus Mausgehirnen verwendet (Zellkulturansatz): For this purpose, we performed in vitro transwell assays with endothelial cells (endothelial cell transwell assay, ECTA) of primary cultured capillary endothelial cells from mouse brains used (cell culture approach):
    Primäre Kulturen von Endothelzellen aus Gehirnkapillaren von ABCB1-defizienten, ABCC1-defizienten (knock out) Mäusen und von Kontrollmäusen (C57Bl/6, FVB/N) wurden genutzt, um die Aβ-spezifische Transportaktivität zu untersuchen. Primary cultures of endothelial cells of brain capillaries of ABCB1-deficient, ABCC1-deficient (knock out) mice and from control mice (C57BL / 6, FVB / N) were used to investigate the Aβ-specific transport activity. Der Transport von Aβ42 aus dem abluminalen (Gehirn) in das luminale(Blut)-Kompartment ist bei ABCB1-defizienten und ABCC1-defizienten Endothelien beeinträchtigt. The transport of Aβ42 from the abluminal (brain) in the luminal (blood) -Kompartment is impaired in ABCB1 and ABCC1-deficient deficient endothelial cells. Die mittlere Aβ42-Transportrate während der ersten sechs Stunden nach Gabe von Aβ42-Peptiden betrug 2,2 pg/min für die Kontrollzellen. The mean Aβ42-transport rate during the first six hours after administration of Aβ42 peptides was 2.2 pg / min for the control cells. Im Gegensatz dazu erreichten die ABCC1-defizienten Zellen nur die halbe Transportkapazität (1,0 pg/min). In contrast, the ABCC1-deficient cells reached only half the transmission capacity (1.0 pg / min). In den ABCB1-defizienten Zellen war der Aβ42-Transport nahezu nicht vorhanden (0,3 pg/min). In the ABCB1-deficient cells of the Aβ42-transport was virtually not present (0.3 pg / min). Weitere Untersuchungen an Kapillarendothelien und Zellen aus dem Plexus choroideus ergaben, dass der Transporter ABCB1 stark in Gehirnkapillarendothelien exprimiert wird, wohingegen die endotheliale ABCC1-Expression in Hirnkapillaren viel geringer ist. Further studies on capillary endothelium and cells of the choroid plexus showed that the ABCB1 transporter is highly expressed in Gehirnkapillarendothelien, whereas the endothelial ABCC1 expression is much lower in brain capillaries.
  • [0012] [0012]
    Anhand neu generierter ABC-Transporter-defizienter Alzheimer Mausmodelle wurde dann die relative Signifikanz von Mitgliedern der ABC-Transporterfamilie in vivo untersucht. On the basis of newly generated ABC transporter-deficient Alzheimer mouse models, the relative significance of members of the ABC transporter family was studied in vivo. Die gentechnisch veränderten Mäuse weisen jeweils eine Defizienz (knock out) an spezifischen ABC-Transportern ABCG2, ABCB1 oder ABCC1 auf. The genetically modified mice each have a deficiency (knock out) at specific ABC transporters ABCG2, ABCB1 or ABCC1.
  • [0013] [0013]
    Die Aβ-Immunohistochemie von Gehirnschnitten zeigte: The Aβ immunohistochemistry of brain sections showed:
    • i) signifikante Anstiege in der kortikalen Anzahl und der Größe Aβ-positiver Plaques in ABCC1-defizienten Mäusen verglichen zu Kontrollmäusen (siehe i) significant increases in the number and size of cortical Aβ-positive plaques in ABCC1-deficient mice compared to control mice (see 1 1 und and 2a 2a –c). -C).
    • ii) ABCB1-defiziente Mäuse zeigten einen geringeren Anstieg der Anzahl und Größe von Aβ-Plaques als ABCC1-defiziente Mäuse. ii) ABCB1-deficient mice showed a lower increase in the number and size of Aβ plaques as ABCC1-deficient mice.
    • iii) Zwischen Kontrollmäusen und ABCG2-defizienten Mäusen konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden ( iii) intermediate could control mice and ABCG2-deficient mice, no significant difference observed ( 2a 2a –c). -C).
  • [0014] [0014]
    Zur Bestimmung der Menge an pufferlöslichem Aß (größtenteils Monomere und kleinere Oligomere) und an Guanidin-löslichem Aβ (größtenteils fibrilläres bzw. aggregiertes Material) wurden enzymgekoppelte Immunadsorptionstests (Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay, ELISAs) für Aβ40 und Aβ42 verwendet. To determine the amount of pufferlöslichem Aß (mostly monomers and smaller oligomers) and guanidine soluble Aβ (mostly fibrillar or aggregated material) enzyme-linked immunosorbent assays (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) were used for Aβ40 and Aβ42.
  • [0015] [0015]
    In Übereinstimmung mit den morphologischen Ergebnissen aus der Immunohistochemie zeigten die ABCC1-defizienten Mäuse einen signifikanten Anstieg bei aggregiertem Aβ42 im Vergleich zu den Kontrollmäusen zu allen Messungszeitpunkten. In accordance with the morphological results of the immunohistochemistry ABCC1-deficient mice showed a significant increase in aggregated Aβ42 as compared to the control mice at all measurement time points. Die zerebrale Belastung mit Aβ40 und Aβ42 war in einem Alter von 25 Wochen am stärksten. Cerebral load Aβ40 and Aβ42 with was strongest at the age of 25 weeks. Zu diesem Zeitpunkt waren die Aβ-Werte 12-mal höher als bei den Kontrollmäusen. At this time, Aβ levels were 12 times higher than in the control mice. Pufferlösliches Aß stieg mit dem Alter ebenfalls an, aber nach 25 Wochen, zum Zeitpunkt der höchsten Plaques-Belastung, fielen die Werte des löslichen Aβs in der ABCC1-defizienten Gruppe stark ab. Buffer-soluble Aß also increased with age, but after 25 weeks at the time of highest plaque load, the values of the soluble Aβs fell into the ABCC1-deficient group strongly.
  • [0016] [0016]
    Weitere Untersuchungen wurden durchgeführt, welche weitere Belege für den Zusammenhang zwischen dem ggf. fehlenden Abtransport durch ABCC1 und der Aggregation von Aß lieferten. Further investigations were carried out, which provided further evidence on the relationship between the possibly missing removal by ABCC1 and the aggregation of Aß.
  • [0017] [0017]
    Die Transportkinetiken von ABC-Transportern hängen unter anderem von spezifischen Protein-/Peptidcharakteristika wie der Ladung ab. The transport kinetics of ABC transporters depend inter alia on specific protein / peptide characteristics such as charge. Die Dutch-type-Variante des APP (holländische Mutante, APP dt ), welche eine zusätzliche negative Ladung nahe der Schnittstelle der α-Sekretase des APP einführt und so zu einer schweren zerebralen Amylodiangiopathie (CAA) führt, beeinflusst die Eliminierung des Aß dt über die Blut-Hirn-Schranke. The Dutch-type variant of APP (Dutch mutant APP dt), which introduces an additional negative charge near the interface of the α-secretase APP and thus of severe cerebral Amylodiangiopathie (CAA) leads affects the elimination of Aß dt the blood-brain barrier. Die Western-blot-Analysen von angereicherten Gehirnkapillaren und von Plexus choroideus (CP) aus Kontrollmäusen zeigten eine starke Expression von ABCB1 in zerebralen Kapillarendothelien (BC) und von ABCC1 im CP ( The Western blot analysis of enriched brain capillaries and choroid plexus (CP) from control mice showed a strong expression of ABCB1 in cerebral capillary endothelium (BC) and ABCC1 in CP ( 3d 3d ). ). Da ABC-Transporter eine wichtige Rolle bei der Eliminierung des Aß spielen, wurde angenommen, dass ABC-Transporter-defiziente (an der Blut-Hirn-Schranke und an der Blut-Plexus choroideus-Schranke) APP dt -transgene Mäuse eine verstärkte Akkumulation von Aβ dt in meningealen Gefäßen aufweisen. Since ABC transporters play an important role in the elimination of Aß, it was assumed that ABC transporter-deficient (at the blood-brain barrier and the blood-choroid plexus barrier) APP transgenic mice dt increased accumulation of Aβ dt in meningeal vessels have. Der Grad der CAA in den ABC-defizienten APP dt -Mäusen wurde im Alter von 24 Monaten quantifiziert. The degree of CAA in the ABC-deficient APP dt mice was quantified at the age of 24 months. In Übereinstimmung mit der Annahme waren 51% der Gefäße schwer beeinträchtigt (> 75% der Gefäßwand mit Aß beladen) bei den ABCC1-defizienten Tieren gegenüber 23% bei den Kontrollen ( In agreement with the assumption 51% of the vessels were severely affected (> 75% of the vessel wall with Aß load) at the ABCC1-deficient mice compared with 23% in the controls ( 3c 3c ). ).
  • [0018] [0018]
    Auf Basis dieser Ergebnisse wurde untersucht, inwieweit der Gehalt an löslichem Aß im Gehirn durch wirkstoffvermittelte Aktivierung von ABC-Transportern verringert/beeinflusst werden konnte. Based on these results, it was investigated to what extent the content could be reduced to soluble Aß in the brain by drug-mediated activation of ABC transporters / affected. Mäuse mit Amyloidablagerungen wurden für 30 Tage mit dem anti-emetischen Thiethylperazin (Torecan ® , 2-(Ethylthio)-10-[3-(4-methylpiperazin-1-yl)propyl]-10H-phenothiazin) behandelt. Mice with amyloid deposits were incubated for 30 days with the anti-emetic thiethylperazine (Torecan ®, 2- (ethylthio) -10- [3- (4-methylpiperazin-1-yl) propyl] -10H-phenothiazine) treated. Zweimal täglich wurden 3 mg/kg Körpergewicht intramuskulär verabreicht. Twice daily 3 mg / kg body weight were administered intramuscularly. Die prophylaktische Behandlung begann bereits bevor die Mäuse senile Plaques ausbilden. Prophylactic treatment began before the mice develop senile plaques. Thiethylperazin induziert ABCC1 und hemmt jedoch geringfügig die Funktion von ABCB1. Thiethylperazine induced ABCC1 and but slightly inhibits the function of ABCB1. ELISA-Messungen der behandelten Tiere zeigten eine Reduktion der Aβ42-Menge von 31% bei den behandelten Mäusen im Vergleich zu mit Vehikel-behandelten Tieren (Vehikel = Wasser) ( ELISA measurements of the treated animals showed a reduction of Aβ42 amount of 31% in the treated mice compared to vehicle-treated animals (vehicle = water) ( 3e 3e ). ). Die Ergebnisse sind graphisch in The results are shown graphically in 3 3 wiedergegeben. reproduced.
  • [0019] [0019]
    Die Fähigkeit zur Entfernung von Aß erwies sich als ein Schlüsselfaktor bei der Regulation der intrazerebralen Akkumulation von Aß. The ability to remove Aß proved to be a key factor in the regulation of intracerebral accumulation of Aß.
  • [0020] [0020]
    Als besonders effizienter Aktivator des ABCC1-Transporters erwies sich Thiethylperazin (Torecan ® ). A particularly efficient activator of ABCC1 transporter proved thiethylperazine (Torecan ®). Weitere Derivate ausgehend vom selben Grundgerüst, die nicht vom Schutzumfang der Patentansprüche abgeckt sind, könnten ebenfalls gute Ergebnisse bei der Aktivierung des ABCC1-Transporters zeigen. Further derivatives starting from the same basic structure that are not abgeckt from the scope of the claims, may also show at the activation of the ABCC1 transporter good results. Die entsprechenden Derivate inklusive Thiethylperazin sind in der allgemeinen Formel I dargestellt The corresponding derivatives including thiethylperazine are shown in the general formula I
    Figure DE102010062810B4_0004
    wobei die Reste where the radicals
    R 1 und R 2 gleich oder verschieden sind und jeweils unabhängig voneinander C 1 -C 6 -Alkylgruppen sind, welche unabhängig voneinander gegebenenfalls einen weiteren Substituenten ausgewählt aus Alkyl-, Aryl-, Acyl-, Acetyl-, Amino-, Nitro-, Sulfonyl-, Hydroxyl-, Alkoxy-, Aryloxy-, Arylthio-, Alkylthio-Gruppe und Halogenatom aufweisen, wobei die jeweiligen Alkylgruppen gegebenenfalls mindestens ein weiteres Halogenatom aufweisen und der Rest R 1 and R 2 are identical or different and are each independently C 1 -C 6 alkyl groups, which are independently optionally a further substituent selected from alkyl, aryl, acyl, acetyl, amino, nitro, sulfonyl -, hydroxy, alkoxy, aryloxy, arylthio, alkylthio group and halogen atom have, wherein the respective alkyl groups optionally having at least one additional halogen atom and the remainder
    R 3 sich an einer der Positionen 6–9 des Phenothiazin-Ringsystems, vorzugsweise an Position 6, 7 oder 8, befindet und ein Wasserstoffatom oder eine Alkyl-, Aryl-, Acyl-, Acetyl-, Amino-, Nitro-, Sulfonyl-, Hydroxyl-, Alkoxy-, Aryloxy-, Arylthio- oder Alkylthio-Gruppe oder ein Halogenatom ist, wobei die jeweiligen Alkylgruppen gegebenenfalls mindestens ein weiteres Halogenatom aufweisen, oder eine NR 4 R 5 - oder OR 6 -Gruppe ist, wobei R 4 , R 5 und R 6 gleich oder verschieden sind und jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff und C 1 -C 3 -Alkylgruppe und der Rest R 3 at one of the positions 6-9 of the phenothiazine ring system, preferably in position 6, 7 or 8, and is a hydrogen atom or an alkyl, aryl, acyl, acetyl, amino, nitro, sulfonyl , hydroxyl, alkoxy, aryloxy, arylthio or alkylthio group or a halogen atom, wherein the respective alkyl groups optionally comprise at least one more halogen atom, or an NR 4 R 5 -, or OR 6 group, wherein R 4, R 5 and R 6 are identical or different and are each independently selected from hydrogen and C 1 -C 3 alkyl group and the rest
    R 7 sich an einer der Positionen 1, 2 oder 4 des Phenothiazin-Ringsystems, vorzugsweise an Position 2 oder 4, befindet und ein Wasserstoffatom oder eine Alkyl-, Aryl-, Acyl-, Acetyl-, Amino-, Nitro-, Sulfonyl-, Hydroxyl-, Alkoxy-, Aryloxy-, Arylthio- oder Alkylthio-Gruppe oder ein Halogenatom ist, wobei die jeweiligen Alkylgruppen gegebenenfalls mindestens ein weiteres Halogenatom aufweisen, oder eine NR 8 R 9 - oder OR 10 -Gruppe ist, wobei R 8 , R 9 und R 10 gleich oder verschieden sind und jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff und C 1 -C 3 -Alkylgruppe. R 7, at one of positions 1, 2 or 4 of the phenothiazine ring system, preferably at position 2 or 4, and is a hydrogen atom or an alkyl, aryl, acyl, acetyl, amino, nitro, sulfonyl , hydroxyl, alkoxy, aryloxy, arylthio or alkylthio group or a halogen atom, wherein the respective alkyl groups optionally comprise at least one more halogen atom, or an NR 8 R 9 -, or OR 10 group, wherein R 8, R 9 and R 10 are identical or different and are each independently selected from hydrogen and C 1 -C 3 alkyl group. Diese Derivate sind entsprechend gut geeignet zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen, wobei Behandlung wie oben erwähnt sowohl die Prophylaxe als auch die Behandlung bereits bestehender Erkrankungen umfasst. These derivatives are accordingly suitable for the treatment of neurodegenerative diseases, wherein the treatment as mentioned above includes both the prophylaxis and the treatment of existing disease.
  • [0021] [0021]
    Das Halogenatom/die Halogenatome können vorzugsweise ausgewählt sein aus Fluor und Chlor. The halogen atom /, the halogen atoms may be preferably selected from fluorine and chlorine.
  • [0022] [0022]
    Vorzugsweise können die Reste R 1 und R 2 gleich oder verschieden und jeweils unabhängig voneinander eine C 1 -C 3 -Alkylgruppe sein. Preferably, the radicals R 1 and R 2 are identical or different and each independently be a C 1 -C 3 alkyl group. Weiterhin können die Reste R 3 und R 7 Wasserstoff sein. Furthermore, the radicals R 3 and R 7 may be hydrogen.
  • [0023] [0023]
    Erfindungsgemäß ist der Rest R 1 eine Methylgruppe, der Rest R 2 eine Ethylgruppe und die Reste R 3 und R 7 Wasserstoff (Thiethylperazin, Torecan ® ). According to the invention the radical R 1 is a methyl group, the radical R 2 is an ethyl group and the radicals R 3 and R 7 is hydrogen (thiethylperazine, Torecan ®).
  • [0024] [0024]
    Bei der Verwendung zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, dem 2-(Ethyl-thio)-10-[3-(4-methyl-piperazin-1-yl)propyl]-10H-phenothiazin weitere Wirkstoffe, vorzugsweise 1-Benzhydrylpiperazine, höchst bevorzugt 1-Benzhydryl-4-cinnamyl-piperazin (Cinnarizin), zuzusetzen. When used for the treatment of neurodegenerative diseases, it has proved to be advantageous, the 2- (ethyl-thio) -10- [3- (4-methyl-piperazin-1-yl) propyl] -10H-phenothiazine further active compounds, preferably 1 -Benzhydrylpiperazine, most preferably 1-benzhydryl-4-cinnamyl-piperazine (cinnarizine) to add.
  • [0025] [0025]
    Verschiedene neurodegenerative Erkrankungen können mit dem erfindungsgemäßen 2-(Ethyl-thio)-10-[3-(4-methyl-piperazin-1-yl)propyl]-10H-phenothiazin behandelt werden. Various neurodegenerative diseases can be treated with the inventive 2- (ethyl-thio) -10- [3- (4-methyl-piperazin-1-yl) propyl] -10H-phenothiazine.
  • [0026] [0026]
    In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die neurodegenerative Erkrankung eine β-Amyloidopathie, insbesondere Alzheimer Demenz (AD). In a particularly preferred embodiment, the neurodegenerative disease is a β-Amyloidopathie, in particular Alzheimer's disease (AD).
  • [0027] [0027]
    Eine andere Ausführungsform betrifft den Fall, dass die neurodegenerative Erkrankung eine α-Synucleinopathie, insbesondere Parkinson'sche Erkrankung (PD) oder Lewy-Körperchen-Demenz (LBD), ist. Another embodiment relates to the case that the neurodegenerative disease is an α-Synucleinopathie, in particular Parkinson's disease (PD) or Lewy body dementia (LBD) is.
  • [0028] [0028]
    Weitere mögliche zu behandelnde Erkrankungen sind: Other possible diseases to be treated are:
    • – Huntington'sche Erkrankung (HD), - Huntington's disease (HD),
    • – Prion-Erkrankung, insbesondere Creutzfeld-Jacob-Erkrankung (CJD) oder Fatale Familiäre Insomnie (FFI), Tauopathie, insbesondere Cortico-Basale-Degeneration (CBD), Steel-Richardson-Olszewski-Syndrom (PSP, progessive supranuclear palsy, progressive supranukleäre Blickparese), Alzheimer Demenz (AD) oder Pick'sche Erkrankung (PiD), Frontotemporale Degeneration (FTLD), insbesondere Ubiquitin-positive Degeneration, TDP43-positive Degeneration oder für Ubiquitin- und TDP43-negative Degenerationen, amylotrophe Lateralsklerose (ALS), - Prion disease, especially Creutzfeld-Jacob disease (CJD) or fatal familial insomnia (FFI), tauopathy, particularly Cortico-basal degeneration (CBD), Steel-Richardson-Olszewski syndrome (PSP, progessive supranuclear palsy, progressive supranuclear palsy), Alzheimer's disease (AD) or Pick's disease (PiD), frontotemporal degeneration (FTLD), in particular ubiquitin-positive degeneration, TDP43-positive degeneration or for ubiquitin and TDP43-negative degenerations amylotrophic lateral sclerosis (ALS),
    • – spinozerebelläre Ataxie (SCA) oder spastische Paraparese (SPG), - Spinocerebellar ataxia (SCA) or spastic paraparesis (SPG),
    • – Multiple Sklerose (MS) oder ein MS-verwandtes Syndrom, insbesondere ADEM oder Devic-Syndrom. - Multiple sclerosis (MS) or MS-related syndrome, in particular ADEM or Devic syndrome.
  • Beschreibung der Abbildungen Description of the Figures
  • [0029] [0029]
    Es zeigen Shown
  • [0030] [0030]
    dass die kortikale Dichte neuritischer Plaques bei ABCC1-defizienten Mäusen (ABCC1ko) um ~75% erhöht ist; that the cortical density of neuritic plaques in ABCC1-deficient mice (ABCC1ko) is increased by ~ 75%;
  • [0031] [0031]
    , c dass die mittlere Plaquegröße erhöht ist (+34%) aufgrund der größeren Anzahl an Plaques (+63%) mit einer Größe von mehr als 700 μm 2 und einer geringeren Häufigkeit kleinerer Plaques (–24%). , C that the average plaque size is increased (+ 34%) due to the larger number of plaques (+ 63%) with a size greater than 700 microns 2 and a lower frequency smaller plaques (-24%). Fehlerbalken, Standardfehler (n ≥ 3); Error bars, standard error (n ≥ 3);
  • [0032] [0032]
    dass die IHC-Färbung bei ABCG2-defizienten (ABCG2ko)-, ABCB1-defizienten-(ABCB1ko)-, ABCC1-defizienten(ABCC1ko)-Mäusen und bei Kontroll-Mäusen eine höhere Flächendichte an Aß bei ABCC1-defizienten Tieren zeigt. that the IHC staining in ABCG2-deficient (ABCG2ko) -, ABCB1 defizienten- (ABCB1ko) -, ABCC1-deficient (ABCC1ko) mice and control mice a higher surface density of Aß in ABCC1-deficient mice shows. Typische Plaques derselben Größe sind im Ausschnitt dargestellt, Skalierungsbalken stellen 500 μm (Übersicht) und 50 μm (Ausschnitt) dar (*p < 0,05); Typical plaques of the same size are shown in the cut, scale bars represent 500 microns (Overview) and 50 microns (detail) is (* p <0.05);
  • [0033] [0033]
    dass die Plaquedichte im Kortex (Bedeckung) und die Größe bei spezifischen ABC-Transporter-knockout-Mäusen erhöht ist. that the plaque density in the cortex (cover) and the size is increased in specific ABC transporter knockout mice. Insbesondere ABCC1-defiziente (ABCC1ko) Mäuse zeigen eine erhöhte Aβ-Amyloidbelastung (hellgraue Balken, jeweils rechts außen in den einzelnen Gruppierungen), w = Woche auf der Abszisse; In particular, ABCC1-deficient (ABCC1ko) mice exhibit increased Aβ-amyloid load (light gray bars, respectively the far right of the individual groups), w = week on the abscissa;
  • [0034] [0034]
    dass die Gesamtplaquegröße bei ABCC1-defizienten (ABCC1ko) und ABCB1-defizienten (ABCB1ko) Mäusen im Alter von 25 Wochen erhöht ist, w = Woche auf der Abszisse; that the total plaque size is increased in ABCC1-deficient (ABCC1ko) and ABCB1-deficient (ABCB1ko) mice aged 25 weeks w = week on the abscissa;
  • [0035] [0035]
    dass der Gesamtanstieg in der Plaquegröße mit dem Auftreten weniger kleiner Plaques und mehr größerer Plaques (> 700 μm 2 ) assoziiert ist, wohingegen die Anzahl mittelgroßer Plaques auf dem selben Wert bleibt, Fehlerbalken, Standardfehler (n ≥ 5), *p < 0,05; that the overall increase in plaque size with the appearance of less smaller plaques and more larger plaques (> 700 microns 2) is associated, whereas the number of medium-sized plaques remains at the same value, error bars, sem (n ≥ 5), * p <0, 05;
  • [0036] [0036]
    dass die Defizienz von ABCC1 die Akkumulierung von Aβ und Aβ dt fördert und dass die Aktivierung von ABCC1 (durch Gabe von Torecan) die Aβ-Werte senkt; that the deficiency of ABCC1 promotes the accumulation of Aβ and Aβ dt and that activation of ABCC1 reduces (by administration of Torecan) the Aβ values; wobei in which
  • [0037] [0037]
    zeigt, dass in einem Alter von 25 Wochen ABCC1-Defizienz zu einem markanten Anstieg (~12fach) bei unlöslichem Aß führt; shows that in 25 weeks of age ABCC1 deficiency in a marked increase (~ 12x) results in insoluble Aß; und and
  • [0038] [0038]
    zeigt, dass die Menge an pufferlöslichem Aβ42 in einem Alter von 25 Wochen merklich reduziert ist im Vergleich zu 22 Wochen (–56%). shows that the amount of pufferlöslichem Aβ42 is significantly reduced at an age of 25 weeks compared with 22 weeks (-56%). Dies beruht wahrscheinlich auf der Ablagerung in unlöslichen Depots. This is probably due to the deposition in insoluble deposits. Im selben Alter ist die von Aβ-Ablagerungen belegte Fläche, welche in der Immunhistochemie gemessen wird, um 83% erhöht (Fehlerbalken Standardfehler n ≥ 5, p < 0,05); At the same age (error bars the standard error n ≥ 5, p <0.05) is the area occupied by Aβ deposition surface, which is measured in immunohistochemistry, increased by 83%;
  • [0039] [0039]
    zeigt, dass 53% der Blutgefäße schwer durch CAA beeinträchtigt sind (> 75% der Gefäßwände weisen Aß auf). shows that 53% of the blood vessels are severely affected by CAA (> 75% of the vessel walls have to Aß). Dies betrifft ABCC1-defiziente Mäuse (ABCC1ko) im Vergleich zu 23% bei den Kontrollen (n = 3); This concerns ABCC1-deficient mice (ABCC1ko) compared to 23% in the controls (n = 3);
  • [0040] [0040]
    zeigt, dass die Expression von ABCC1 prädominant im Plexus choroideus (CP) zu sehen ist, wohingegen ABCB1 hauptsächlich in den Kapillaren des Gehirns (BP) exprimiert ist; shows that the expression of ABCC1 predominant in the choroid plexus (CP) can be seen, whereas ABCB1 mainly in the capillaries of the brain (BP) is expressed;
  • [0041] [0041]
    e zeigt, dass die Aktivierung von ABCC1 durch Thiethylperazin (Torecan) die Aβ-Werte bei Mäusen senkt (–28%), Fehlerbalken, Standardfehler (n = 4, *p < 0,05). e shows that the activation of ABCC1 by thiethylperazine (Torecan) the Aβ levels in mice decreases (-28%), error bars, standard error (n = 4, * p <0.05).
  • Beispiele Examples
  • Tiere Animals
  • [0042] [0042]
    APP-transgene Mäuse (APP, APP dt ) wurden von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, USA) und der Universität Tübingen (Tübingen, Deutschland) bezogen. APP-transgenic mice (APP, APP dt) was obtained from The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine) and the University of Tübingen (Tübingen, Germany). Die NEP-defizienten Mäuse waren ein Geschenk vom Riken Brain Research Institute (Saitama, Japan). The NEP-deficient mice were a gift from the Riken Brain Research Institute (Saitama, Japan). ABCG2-, ABCB1-, und ABCC1-defiziente Mäuse wurden von Taconic Farms (Dänemark) bezogen. ABCG2-, ABCB1, ABCC1, and-deficient mice were purchased from Taconic Farms (Denmark). Alle transgenen und knockout Mauslinien wurden für mindestens 9 Generationen in den genetischen FVB-Hintergrund eingekreuzt. All transgenic and knockout mouse lines were bred for at least 9 generations in the genetic FVB background. Die Mäuse wurden in 12 h/12 h Licht/Dunkelheit-Zyklus bei 23°C gehalten mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser. The mice were maintained in 12 h / 12 h light / dark cycle at 23 ° C with free access to food and water.
  • Methoden Methods
  • Gewebepräparation Tissue Preparation
  • [0043] [0043]
    Zur Gewebepräparation wurden die Mäuse durch zervikale Dislokation getötet und transkardial mit PBS (Phosphat-gepufferte, physiologische Kochsalzlösung) perfusioniert. The mice were sacrificed by cervical dislocation for tissue preparation and perfused transcardially with PBS (phosphate-buffered physiological saline). Das Gehirn wurde entfernt und eine Hemisphäre in gepuffertem, 4%-igem Paraformaldehyd für Parafineinbettung und Immunohistochemie gelagert. The brain was removed and stored for a hemisphere in buffered 4% paraformaldehyde for Parafineinbettung and immunohistochemistry. Die andere Hemisphäre wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80°C für biochemische Analysen gelagert. The other hemisphere was stored in liquid nitrogen, snap-frozen and stored at -80 ° C for biochemical analysis.
  • ELISA ELISA
  • [0044] [0044]
    ELISA-Kits (TH40HS, TK42HS-hochsensitiv) von The Genetics Company (Schlieren, Schweiz, aktuell eine Abteilung von Merck/Millipore) wurden für die Quantifizierung von Aβ40 und Aβ42 verwendet. ELISA kit (TH40HS, TK42HS-high sensitivity) of The Genetics Company (Schlieren, Switzerland, currently a division of Merck / Millipore) were used for the quantification of Aβ40 and Aβ42. Gehirnhemisphären wurden unter Verwendung von Pre-Cellys24 (12 s, 6.500 rpm) homogenisiert. (6500 rpm 12 s) were brain hemispheres using pre-Cellys24 homogenized. Nach Zusatz von Carbonatpuffer (pH 8,0) wurden die Homogenisate unter Verwendung von PreCellys gemischt (5 s, 5.000 rpm) und 90 min zentrifugiert bei 4°C und 24.000 g, um unlösliche von löslichen Aβ-Spezies zu trennen. After the addition of carbonate buffer (pH 8.0) The homogenates were mixed using Precellys (5 s, 5000 rpm) and centrifuged for 90 min at 4 ° C and 24,000 g to separate soluble from insoluble Aβ species. Der verbleibende Überstand (pufferlösliche Fraktion) wurde mit 8M Guanidinhydrochlorid in einem Verhältnis von 1:1,6 gemischt. The remaining supernatant (buffer-soluble fraction) was treated with 8M guanidine hydrochloride at a ratio of 1: 1.6. Zur Extraktion der aggregierten Aβ-Spezies wurde das Pellet in 8 Volumen von 5M Guanidinhydrochlorid gelöst, bei Raumtemperatur 3 h geschüttelt und bei 24.000 g für 20 min bei 4°C zentrifugiert. To extract the aggregated Aβ species, the pellet was dissolved in 8 volumes of 5 M guanidine hydrochloride, shaken for 3 h at room temperature and centrifuged at 24,000 g for 20 min at 4 ° C. Der verbleibende Überstand stellte die Guanidin-lösliche Fraktion dar (GuaHCl). The remaining supernatant presented the guanidine-soluble fraction is (GuaHCl). Proteingehalte aller Proben wurden dreifach gemessen, wobei ein Nanodrop1000 Spektrophotometer verwendet wurde (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, USA). Protein concentrations of all samples were measured in triplicate, with a Nanodrop1000 spectrophotometer was used (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, USA). Die ELISAs wurden gemäß Herstelleranweisung unter Verwendung passender Verdünnungen durchgeführt. The ELISAs were performed according to the manufacturer's instructions using appropriate dilutions.
  • Western Blots Western blots
  • [0045] [0045]
    Für die Western Blots wurden Gewebehomogenisate hergestellt. For the Western blots tissue homogenates were prepared. Die Gesamtproteinkonzentrationen der Extrakte wurden unter Verwendung eines BCA-Assays bestimmt (Pierce, Teil von Thermo Fisher Scientific, Rockford, USA). The total protein concentrations of the extracts were determined using a BCA assay (Pierce, part of Thermo Fisher Scientific, Rockford, USA). Nach der Elektrophorese von 10 μg Gesamtprotein pro Spur wurden die Proteine auf PVDF-Membranen geblottet. After electrophoresis of 10 ug of total protein per lane, the proteins were blotted onto PVDF membranes. Nach Blockade in 5% Trockenmilch in TBST-Puffer (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% Tween20) für 1 h bei Raumtemperatur, wurden die Blots entweder auf ABCB1 (1:500, D-11, Santa Cruz), ABCC1 (1:200, Alexis Bio) oder β-Actin (1:20.000, Sigma) über Nacht bei 4°C untersucht. After blocking in 5% dry milk in TBST buffer (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1% Tween20) for 1 h at room temperature, the blots were either ABCB1 (1: 500, D-11 Santa Cruz), ABCC1 (1: 200, Bio Alexis) or β-actin (1: 20,000, Sigma) was investigated overnight at 4 ° C. Als Detektionsantikörper wurden Anti-Maus-HRP, Anti-Ratte-HRP bzw. Anti-Hase-HRP verwendet. The detection antibody anti-mouse-HRP were anti-rat HRP or anti-rabbit-HRP used. Für die Visualisierung wurden ein Amersham ECL Plus Detektionskit und eine Roper CoolSnap HQ 2 -Kamera verwendet. For the visualization of an Amersham ECL Plus detection kit and a Roper CoolSNAP HQ camera 2 were used.
  • Immunohistochemie (IHC) Immunohistochemistry (IHC)
  • [0046] [0046]
    Formalin-fixierte Gehirne wurden in Parafin eingebettet und in 4 μm-dicke Sektionen geschnitten. Formalin-fixed brains were embedded in paraffin and cut into 4 micron thick sections. Nach Entfernung des Parafins wurden die Sektionen mit einem BondMax TM Autostainer (Menarini/Leica, Deutschland) weiter behandelt. After removal of the Parafins Sections were incubated with a BondMax TM Autostainer (Menarini / Leica, Germany) treated further. Immunofärbung wurde initiert nach Blockade endogener Peroxidase (5 min) und Epitop-Wiederfindung (epitope retrieval) für 5 min mit 95% Ameisensäure (für 6F3D (Dako, Deutschland) und Aβ42-Antikörper, 70% Ameisensäure (für Antikörper 4G8, Millipore, Deutschland).. Primäre Antikörper wurden routinemäßig bei Raumtemperatur für 30 min mit folgenden Verdünnungen inkubiert: Dako-Clone 6F3D (1:100), 4G8 (1:500); Aβ42 (1:800). Primäre Antikörper wurden mit dem BondMax TM Bond Polymer Refine Detektionskit und nach dem Standardprotokoll DAB R30 detektiert. Die Schnitte wurden vollständig digitalisiert mit einer Auflösung von 230 nm unter Verwendung eines MiraxDesk/MiraxMidi-Scanners und anschließend automatisch analysiert unter Verwendung des AxioVision-Softwarepakets (Zeiss, Deutschland). Immunostaining was initiated by blockade of endogenous peroxidase (5 min) and epitope retrieval (epitope retrieval) for 5 min with 95% formic acid (for 6F3D (Dako, Germany) and Aβ42 antibodies, 70% formic acid (for antibody 4G8, Millipore, Germany ) .. Primary antibodies were routinely at room temperature for 30 min with the following dilutions: Dako-clone 6F3D (1: 100), 4G8 (. 1: 500); Aβ42 (1: 800) Primary antibodies were detected with the BondMax TM Bond Polymer Refine Detection Kit and Sections were fully digitized with a resolution of 230 nm using a MiraxDesk / MiraxMidi scanner and then automatically analyzed using the AxioVision software package (Zeiss, Germany) detected by the standard protocol DAB R30..
  • Bewertung des Schweregrades der CAA Evaluation of the severity of CAA
  • [0047] [0047]
    Gehirnschnitte von APP dt -Mäusen wurden mit 4G8-Antikörper angefärbt. Brain sections from APP dt mice were stained with 4G8 antibody. Zumindest zwei nicht aufeinander folgende Sektionen wurden auf CAA der Hirnhautgefäße in verblindeter Weise untersucht. At least two non-consecutive sections were examined for CAA of meningeal vessels in a blinded manner. Alle Hirnhautgefäße wurden manuell gezählt und der Schweregrad der CAA wurde wie folgt kategorisiert: All meningeal vessels were manually counted and the severity of CAA was categorized as follows:
    Kategorie I: nicht beeinträchtigt Category I: not affected
    Kategorie II: ≤ 25% der Peripherie positiv eingefärbt Category II: ≤ 25% of the peripheral stained positively
    Kategorie III: ≤ 50% der Peripherie positiv eingefärbt Category III: ≤ 50% of the peripheral stained positively
    Kategorie IV: ≤ 75% der Peripherie positiv eingefärbt Category IV: ≤ 75% of the peripheral stained positively
    Kategorie V: ≤ 100% der Peripherie positiv eingefärbt Category V: ≤ 100% of the peripheral stained positively
    Die mittlere Anzahl an Gefäßen zu jeder Kategorie wurde relativ zur Gesamtzahl aufgefundener Gefäße kalkuliert. The average number of vessels in each category was calculated relative to the total number aufgefundener vessels.
  • Endothelzellen-Transwell-Assay (ECTA) Endothelial cell transwell assay (ECTA)
  • [0048] [0048]
    Endothelzellen von Mausgehirnkapillaren wurden wie bei Coisne et al. Endothelial cells were carried out as Mausgehirnkapillaren Coisne et al. beschrieben hergestellt (Coisne, C. et al. Mouse syngenic in vitro blood-brain barrier model: a new tool to examine inflammatory events in zerebral endothelium. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology 85, 734–746 (2005)). prepared as described (Coisne, C. et al syngenic mouse in vitro blood-brain barrier model:.. a new tool to examine inflammatory events in cerebral endothelium Laboratory investigation, a journal of technical methods and pathology 85, 734-746 (2005)) , Mindestens zehn 3–4 Wochen alte Mäuse wurden enthauptet und die Gehirne entfernt. At least ten 3-4-week-old mice were decapitated and the brains removed. Nach Dissektion des Hirnstamms, der weißen Substanz und der Hirnhaut wurde das Gewebe in zwei Volumen Waschpuffer B homogenisiert (WBB) (Hanks buffered salt solution (HBBS), 10 mM HEPES, 0,1% BSA) unter Verwendung eines 15 ml Glassdouncers (Wheaton Industries, Millville, NJ; USA). After dissection of the brain stem, the white matter and meninges, the fabric was in two volumes of Wash Buffer B homogenized (WBB) (Hanks buffered salt solution (HBSS), 10 mM HEPES, 0.1% BSA) using a 15 ml Glassdouncers (Wheaton Industries, Millville, NJ, USA). Ein Volumen von 30% Dextranlösung wurde dem Homogenisat zugegeben. A volume of 30% dextran solution was added to the homogenate was added. Es wurde zweimal bei 3.000 g und 4°C zentrifugiert. It was centrifuged twice at 3000 g and 4 ° C. Das Pellet, welches die Gefäße enthielt, wurde in WBB resuspendiert und große Gefäße wurden manuell durch harsches Pipetieren der Lösung aufgebrochen. The pellet containing the vessels, was resuspended in WBB and large vessels were manually broken up by pipetting the solution harsh. Vakuumfiltration durch 60 μm-Membranen (SEFAR, Schweiz) wurde eingesetzt um große Gefäße von den Kapillaren zu trennen. Vacuum filtration through 60 micron membranes (SEFAR, Switzerland) was used for large vessels to separate from the capillaries. Nach kombinierter Behandlung mit Kollagenase/Dispase (HBSS, 10 mM HEPES, 0,15 μg/ml TCLK, 10 μg/ml DNAse-I, 1 mg/ml Kollagenase/Dispase (Roche) wurde Einzelzellsuspension durch weiteres harsches Pipetieren der Lösung erreicht. Endothelzellen wurden in Matrigel-beschichtete Transwellinserts eingebracht (0,4 μm Poren, Greiner Bio-One, Deutschland) mit einer Dichte von 120.000 Zellen pro Insert und wachsen gelassen auf einer unterstützenden Glialkultur. After combined treatment with collagenase / dispase (HBSS, 10 mM HEPES, 0.15 ug / ml TCLK, 10 ug / ml DNAse I, 1 mg / ml collagenase / dispase (Roche) was single-cell suspension achieved by further harsh pipetting the solution. endothelial cells were placed in Matrigel-coated Transwell inserts (0.4 micron pore, Greiner Bio-One, Germany) at a density of 120,000 cells per insert and allowed to grow to a supportive Glialkultur.
  • [0049] [0049]
    Schwefelgelb wurde zur Bestimmung des parazellulären Flusses während der Assays verwendet. Sulfur Yellow was used to determine the paracellular flux during the assay. Das Kulturmedium des abluminalen Kompartments wurde ersetzt mit einer Lösung, welche 10 ng Aβ42 enthielt (1,6 nM Endkonzentration). The culture medium of the abluminal compartment was replaced with a solution containing 10 ng Aβ42 (1.6 nM final concentration). Anschließend wurden Proben aus dem luminalen Kompartment nach 2 h, 6 h bzw. 24 h entnommen und der Aβ-Gehalt wurde mit ELISA bestimmt (TK42-highsense, TGC, Schweiz). Subsequently samples from the luminal compartment after 2 h, 6 h and 24 h and removed the Aβ content was determined by ELISA (TK42 high-sense, TGC, Switzerland). Die Transportrate wurde wie ei Coisne et al. The transport rate as egg Coisne et al. beschrieben bestimmt (Coisne, C. et al. Mouse syngenic in vitro blood-brain barrier model: a new tool to examine inflammatory events in zerebral endothelium. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology 85, 734–746 (2005)). described determined (Coisne, C. et al syngenic mouse in vitro blood-brain barrier model:.. a new tool to examine inflammatory events in cerebral endothelium Laboratory investigation, a journal of technical methods and pathology 85, 734-746 (2005)) ,
  • ELISA-Statistiken ELISA Statistics
  • [0050] [0050]
    Der Lilliefors godness-of-fit-Test (α = 0,05) wurde auf die ELISA-Daten und auf die log-transformierten ELISA-Daten angewandt, um zwischen der Annahme von normal verteilten Probendaten und der Annahme log-normal verteilter Probendaten zu unterscheiden. The Lilliefors godness-of-fit test (α = 0.05) was applied to the ELISA data and the log-transformed ELISA data to the assumption of normally distributed between sample data and the assumption of log-normally distributed sample data differ. Trotz der geringen Probengröße wurde für beiden Datensätze die Nullhypothese abgelehnt für 5 von 44 Proben. Despite the small sample size, the null hypothesis was rejected for 5 out of 44 samples for both data sets. In Übereinstimmung mit der Beobachtung überwiegend positiven Versatzes (skew) und strikt positiver Probendaten wurde die Annahme normal verteilter Daten verworfen. In accordance with the observation overwhelmingly positive skew (skew) and strictly positive samples data, the assumption of normally distributed data was discarded. Mittelwerte und Konfidenzintervalle wurden unter der Annahme einer zugrunde liegenden log-normal Verteilung berechnet. Mean values and confidence intervals were calculated assuming an underlying log-normal distribution. Der Wilcoxon-Rank-sum-Test wurde angewandt, um die ELISA-Daten der verschiedenen Mausstränge für jeden Zeitpunkt zu vergleichen. The Wilcoxon Rank-sum test was used to compare the ELISA data of the various mouse lines for each time point.
Patent Citations
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